基于宏基因组二代测序（mNGS）在结核分枝杆菌（MTB）与非结核分枝杆菌（NTM）感染鉴别诊断中的诊断效能：一项大型综合医学中心425例疑似结核感染患者的回顾性研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing in Mycobacterium and non-Mycobacterium infection patients: a retrospective study at a large comprehensive medical center

背景：宏基因组二代测序（mNGS）已成为部分疑难临床病例中具有潜在价值的补充性检测手段，甚至可能成为不可或缺的检测方法。本研究利用多种样本类型（包括支气管肺泡灌洗液（BALF）、脑脊液（CSF）、血液、脓液、组织、胸腔积液和腹水），综合比较了mNGS与结核分枝杆菌IgG抗体（TB-IgG）、结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验（TB-IGRA）、结核分枝杆菌DNA检测（TB-DNA）、GeneXpert MTB/RIF检测（Xpert）、分枝杆菌培养（culture）和抗酸染色（AFS）等其他方法在结核（TB）感染诊断及TB感染与NTM感染鉴别中的诊断价值。方法：回顾性收集2021年至2024年间425例疑似TB感染患者的临床资料，包括影像学、实验室检查结果和病历记录，并根据最终临床诊断将其分为肺结核（PTB）组[306例（72%）]、肺外结核（EPTB）组[67例（15.76%）]和非结核（non-TB）组[52例（12.24%）]。结果：三组之间在年龄、性别、咳嗽、吸烟史、超敏C反应蛋白（hsCRP）、干扰素-γ（IFN-γ）和高血压方面差异有统计学意义（P < 0.05）。根据最终临床诊断，mNGS在所有样本中的敏感性和特异性分别为90.1%（95% CI：0.866–0.927）和75.0%（95% CI：0.618–0.848）。mNGS的敏感性高于TB-IGRA（79.1%）、Xpert（72.4%）、culture（52.3%）、TB-DNA（45.6%）、TB-IgG（36.4%）和AFS（10.7%）。在鉴别TB与非TB方面，mNGS的敏感性较标准培养检测约高37.8%（90.1% vs 36.4%；P < 0.001）。进一步分析还显示，mNGS检出的MTB reads数与通过其他实验室检测测得的MTB载量高度相关（P < 0.05）。对mNGS reads数的ROC曲线分析显示，其诊断MTB的曲线下面积（AUC）为0.9073，当采用推荐的cutoff值4条reads（约登指数0.6934）时，敏感性为73.19%，特异性为96.15%。结论：对于疑似TB或NTM感染的患者，mNGS可作为一种有益的辅助工具，尤其是在常规诊断检测结果无法明确或不确定时。mNGS具有协助鉴别MTB与NTM并提供额外证据以指导合理治疗选择的潜力，但其结果应始终结合临床表现和传统微生物学检测进行解读。

**一、研究背景与问题提出**

结核病（TB）是由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起的传染病，约70%–80%的病例累及肺部。MTBC包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、田鼠分枝杆菌（M. microti）和非洲分枝杆菌（M. africanum），其中90%以上的人类结核感染由M. tuberculosis引起。MTB感染不仅导致活动性结核（ATB），还可导致潜伏性结核感染（LTBI）。典型结核症状（迁延性咳嗽、发热、乏力、盗汗、食欲减退和体重下降）与NTM感染症状相似，仅凭影像学和实验室检查在部分病例中难以将MTB与NTM区分开来。据世界卫生组织（WHO）数据，2020年至2021年结核发病率估计上升3.6%，2021年全球约1060万人罹患结核，中国占全球结核病例的7.4%。因此，早期、准确地检出病原对控制人际传播、防止耐药结核出现及及时启动治疗具有重要意义。

目前临床实验室用于MTB检测的常规方法包括：①免疫学检测：TB-IGRA、TB-IgG和纯化蛋白衍生物（PPD）皮肤试验（TST）；②分子检测：TB-DNA和Xpert；③传统微生物学方法：MTB培养和AFS。然而这些方法的敏感性和特异性均有限：TB-DNA和Xpert对全球病例检出率的提升有限，在肺外结核中效能有限；TB-IGRA、TB-IgG和TST可受宿主免疫状态影响；TST对人体损伤较大并存在一定风险；培养虽是诊断金标准，但耗时长，对早期快速诊断价值有限。近年来，mNGS作为一项新技术，可非靶向、快速、准确地辅助诊断细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体，样本类型涵盖血液、组织、BALF、痰、CSF、胸腔积液和腹水等。但既往研究多集中于病例报告，鲜有系统评价mNGS在PTB、EPTB及NTM感染中诊断性能的研究。为此，研究人员在中国四川开展了一项单中心回顾性临床研究，比较mNGS与TB-IgG、TB-IGRA、TB-DNA、Xpert、培养、AFS及临床影像和最终诊断在MTB和NTM病原检测中的潜在辅助诊断作用。

**二、主要技术方法**

研究纳入2021年至2024年在四川省人民医院接受mNGS检测的住院患者，从医院信息系统筛选符合条件的患者，依据《中国结核病临床诊疗指南（2017年版）》和WHO建议，结合微生物学证据（培养或Xpert MTB/RIF阳性）、影像学（胸部CT）、临床症状（咳嗽≥2周、发热、盗汗、体重下降）、抗结核治疗反应及排除其他诊断确立诊断。共纳入425例疑似TB感染患者，分为PTB（n=306）、EPTB（n=67）和非TB（n=52）三组。样本类型包括CSF、BALF、痰、胸腔积液、组织、腹水、血液、脓液、尿液、骨髓、关节液和分泌物等。主要技术方法包括：mNGS样本处理与DNA提取（采用破壁反应与TIANamp Micro DNA Kit提取DNA）、mNGS文库构建与测序（NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit构建文库，Nextseq 550 DX平台75 bp单端测序，每样本约产生2000万条reads）、mNGS生物信息学分析（去低质量reads后经Burrows–Wheeler Alignment扣除人源序列，剩余数据经SNAP比对NCBI数据库并进行分类学注释和丰度计算），以及TB-IgG、TB-IGRA、TB-DNA、Xpert、培养和AFS等常规检测。统计分析采用McNemar检验、Cohen's kappa检验、Mann–Whitney U检验，并计算敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和约登指数，绘制ROC曲线计算AUC。研究经四川省人民医院医学专业委员会批准（许可号：2022172），因回顾性研究豁免知情同意。

**三、研究结果**

**3.1 研究人群特征**：4150例患者样本接受mNGS检测，425例符合纳入标准。三组间年龄、性别、咳嗽、吸烟史、hsCRP、IFN-γ和高血压差异有统计学意义（P < 0.05）。PTB组中位年龄56（3–91）岁，男性占63.73%，BALF为最常见样本类型（n=264）；EPTB组中位年龄49（6–80）岁，最常见样本为组织、CSF和血液，肺外结核包括结核性脑膜炎/脑膜脑炎（n=24）、结核性胸膜炎（n=4）、泌尿生殖系结核（n=1）、骨关节/脊柱/关节结核（n=13）、结核性腹膜炎（n=3）、腰椎结核（n=17）、皮肤结核（n=2）和淋巴结结核（n=1）；非TB组52例中39例诊断为NTM感染，13例尽管mNGS低reads阳性但最终诊断为其他疾病。

**3.2 mNGS与临床实验室检测的总体表现**：因回顾性研究设计，TB-IgG、TB-IGRA、TB-DNA、Xpert、培养和AFS分别有262、279、221、296、323和356例患者结果未确定。PTB组中Xpert阳性检出率最高（57.52%），但显著低于mNGS（90.52%）；EPTB组中TB-IGRA阳性检出率最高（32.84%），亦显著低于mNGS（88.06%）。非TB组中培养阳性率达28.85%，阳性结果多提示NTM感染。373例确诊TB阳性患者中仅4例（1.07%）七种检测均持续阳性。在完成全部七项检测的91例PTB患者中，mNGS阳性率达100.00%，TB-IGRA（84.62%）次之。

**3.3 mNGS与其他六种常规检测的结果及一致性**：425例患者中mNGS检测MTBC最为有效（349/425，82.12%；P < 0.05）。270例同时接受mNGS、Xpert和培养检测的患者中，116例（42.96%）三者结果完全一致，其中91例PTB和5例EPTB三种方法均阳性；其余154例结果不一致。McNemar检验显示mNGS与培养在所有样本中关系显著（P < 0.001），但kappa统计量为0.267，提示两者无一致性；mNGS与Xpert在所有样本和肺部样本中一致性满意，但肺外样本中不一致。

**3.4 各方法在TB中的诊断性能**：所有临床疑似TB样本中，mNGS敏感性为90.1%（95% CI：0.866–0.927），远高于培养（52.3%）、Xpert（72.4%）、TB-IGRA（79.1%）、TB-IgG（36.4%）、TB-DNA（45.6%）和AFS（10.7%）；mNGS特异性为75%（95% CI：0.618–0.848），略低于Xpert（100%）、TB-DNA（100%）、TB-IgG（91.2%）和TB-IGRA（88.6%），但高于培养（65.9%）；PPV和NPV分别为96.3%和51.3%。313例肺部样本中mNGS敏感性为93.4%，112例肺外样本中为81.4%。ROC分析显示mNGS的AUC为0.825（95% CI：0.754–0.897），低于Xpert（0.862），高于其他检测；基于reads数的ROC曲线AUC为0.9073，推荐cutoff值4条reads时敏感性73.19%、特异性96.15%。

**3.5 影像学对MTBC感染的诊断价值**：回顾所有病例影像学结果并展示代表性病例，发现影像学对腰椎结核诊断具有典型性，但对累及其他器官的结核难以解读，合并其他病原体感染时放射科医师诊断更为困难，因此临床实验室检测结果（包括常规检测和mNGS）对临床诊断具有重要意义。

**3.6 MTBC载量影响mNGS结果**：MTBC细胞壁难以破壁，使mNGS的DNA提取具有挑战性，其敏感性可能受MTBC载量影响。在349例mNGS阳性样本中，TB-IgG、TB-IGRA、TB-DNA、Xpert、培养和AFS阳性组的MTBC reads数显著更高，提示其他常规检测阳性预示高MTBC载量。35例仅1条reads映射至MTBC属或种水平的mNGS阳性样本中，15例经Xpert和/或培养阳性，10例（40%）仅mNGS阳性。

**3.7 IFN-γ释放与淋巴细胞的Spearman相关性**：PTB患者中IFN-γ释放水平与淋巴细胞计数（r = 0.2829，P < 0.0001）和淋巴细胞百分比（r = 0.2927，P < 0.0001）呈正相关；EPTB患者中亦呈正相关（r = 0.3982，P = 0.0397；r = 0.6151，P = 0.0006）；非TB患者中未见相关性。三组中IFN-γ释放与mNGS reads数均无相关性。

**3.8 除MTBC外病原体的感染特征与分布**：MTBC混合感染约占三分之二。除MTBC外，病毒为最常见病原体（PTB、EPTB和非TB组分别为55.88%、31.34%和59.62%），其次为细菌（37.25%、7.46%和84.62%）和真菌（29.08%、4.48%和48.08%）。55种微生物中，人γ疱疹病毒4型（EBV）（n = 107/774）最常见，其次为人β疱疹病毒5型（CMV）（n = 79/774）；检出前五位的细菌为屎肠球菌（n = 22）、肺炎链球菌（n = 19）、铜绿假单胞菌（n = 18）、鲍曼不动杆菌（n = 18）和肺炎克雷伯菌（n = 16）；白色念珠菌为MTBC感染患者中最常见的真菌。

**3.9 非TB组NTM感染特征分析**：40例NTM病原阳性，其中39例位于非TB组、1例位于PTB组。48种微生物中前五位NTM病原为鸟分枝杆菌复合群（MAC）（n = 12/128）、脓肿分枝杆菌（n = 12/128）、分枝杆菌属（n = 4/128）、龟分枝杆菌（n = 3/128）和Mycolicibacterium frederiksbergense（n = 3/128）；最常见病毒为CMV（n = 11/128），烟曲霉为最常见真菌。mNGS对NTM的阳性检出率高于培养、AFS和NTM-PCR；40例mNGS NTM阳性患者中，与最终临床诊断比较，mNGS检测NTM的敏感性为100%（39/39），PPV为97.5%（39/40），但因阴性病例有限（n = 1）且无mNGS阴性结果，特异性和NPV无法可靠评估。NTM reads数与NTM-PCR、培养和AFS阳性组间无相关性，可能与样本量小有关。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，以临床医师诊断作为"金标准"，mNGS敏感性为90.1%，与近期其他疑似骨关节结核、播散性结核和肺结核等研究报道相似或更高；其较高敏感性可能与采用临床最终诊断作为金标准、纳入标准限制为具有高验前概率的疑似患者以及样本量较小有关。mNGS特异性低于Xpert但高于培养，全队列中非TB组13例mNGS低reads（RPM值）提示潜在MTB感染，被判为假阳性。mNGS高敏感性与相对低特异性并存，其无偏、广覆盖、高通量特性可快速检出罕见或难培养病原体，但成本高、数据解读复杂，高敏感性可能因背景微生物群或环境微生物污染而增加假阳性风险，亚优特异性可能导致将非致病微生物误判为致病菌，进而引发不必要的抗结核治疗并延误真实病因识别。为此建议：阳性mNGS结果须结合临床表现、影像学及常规实验室检测解读；对疑似污染微生物推荐采用靶向确证检测（如PCR）或动态监测；应建立本地化的阳性阈值标准以区分真实病原与背景微生物群。本研究因测序平台位于院内，将周转时间（TAT）缩短至24–36 h，而培养对细菌平均需2–3天、真菌7–8天、分枝杆菌42天。研究建议对疑似感染病例从原发病灶采集样本，mNGS不仅可用于BALF、痰和肺组织样本的肺结核检测，还可用于CSF、关节液和脓肿等肺外结核检测。我国BCG疫苗广泛接种可影响结核感染诊断准确性；培养虽为"金标准"且支持药敏试验，但固体培养基可见菌落生长需长达8周，敏感性和阳性率低；AFS成本低、周转快，但敏感性低，难以区分麻风分枝杆菌与NTM，在HIV感染者或低菌载儿童中假阴性常见。分子检测（TB-DNA和Xpert）具有周转快、可检测耐药、敏感性和特异性高等优点，但在HIV感染者粟粒性肺浸润中敏感性有限。免疫学检测（TB-IgG和TB-IGRA）成本低，可用于LTBI识别，但在免疫抑制人群中敏感性低且无法区分LTBI与活动性TB。影像学可辅助诊断和随访，但合并感染或免疫低下时表现可不典型，对肺外结核缺乏特异性。研究局限性包括：回顾性设计导致并非所有患者完成全部检测，且完成全部检测者样本量有限可能引入随机变异；单中心研究样本量相对较小，尤其无菌体液样本数量有限可能引入偏倚；mNGS检测对住院时间和患者预后的临床获益有待进一步研究；基于mNGS检测区分活动性MTB感染与潜伏性MTB感染尚需进一步研究。

**结论译文**：总之，本研究支持mNGS作为疑似分枝杆菌感染管理中辅助诊断方法的潜在作用。研究数据表明，mNGS在MTB检测及与NTM鉴别方面可能较常规方法具有更高的敏感性，从而可能加快对这些常呈隐匿性病原体的诊断。此外，其单次检测即可发现多种微生物混合感染的能力为临床效用增添了新的维度。在患者年龄或样本类型不限、而常规检测或影像学检查无法明确诊断的疑难病例中，mNGS可提供具有临床意义的补充证据以指导治疗决策。然而，研究人员强调mNGS应被视为传统诊断方法的补充而非替代。