《Frontiers in Molecular Biosciences》：Long-read RNA sequencing reveals full-length HERV transcripts and novel ERVE-4 isoforms with potential immunotherapeutic relevance in clear cell renal cell carcinoma
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摘要
引言：人类内源性逆转录病毒（HERVs）日益被认为是肿瘤相关抗原的来源和细胞免疫治疗的潜在靶点。然而，其重复序列和非经典剪接模式使得利用常规短读长RNA测序进行准确的转录本注释变得复杂。本研究旨在利用长读长RNA测序改进HERV转录组注释。
方法：研究人
摘要
引言：人类内源性逆转录病毒（HERVs）日益被认为是肿瘤相关抗原的来源和细胞免疫治疗的潜在靶点。然而，其重复序列和非经典剪接模式使得利用常规短读长RNA测序进行准确的转录本注释变得复杂。本研究旨在利用长读长RNA测序改进HERV转录组注释。
方法：研究人员开发了一种利用长读长RNA测序对HERV表达进行全面注释的生物信息学工作流程，并使用短读长RNA测序进行验证。研究人员将该工作流程应用于ERVE-4，这是一种先前被证明在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中选择性表达并编码免疫原性肽的HERV元件，该肽目前正处于作为细胞免疫治疗靶点的临床研究阶段。
结果：长读长测序捕获了全长HERV转录本，改善了重复区域的比对，并实现了HERV异构体的重建。该工作流程在长读长数据集中鉴定了数百个在相应短读长注释中缺失的HERV位点。对ERVE-4的分析揭示了先前未表征的异构体，其表达通过RT-dPCR在多个ccRCC肿瘤中得到验证。
讨论：长读长RNA测序提高了HERV转录组注释的分辨率和完整性。新型ERVE-4异构体显著扩展了ERVE-4已知的抗原编码潜力，可能意味着在ccRCC中发现用于免疫治疗的新型肽靶点。
论文解读
一、研究背景与问题
人类内源性逆转录病毒（HERVs）是远古逆转录病毒感染在灵长类生殖系中固定后留下的遗迹，约占人类基因组的8%。尽管多数HERV位点因突变和表观遗传沉默而失活，但大量研究表明HERVs可在癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病及神经精神疾病中异常表达。在肿瘤学领域，HERVs作为肿瘤相关抗原的来源和细胞免疫治疗的潜在靶点日益受到关注。研究人员的团队此前鉴定了一个HERV E型元件（命名为CT-RCC HERV-E或ERVE-4），该元件在大多数透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中选择性表达，受HIF-2α转录调控，并编码能够引发T细胞反应的免疫原性肽。研究人员从一例异基因干细胞移植后发生免疫介导ccRCC消退的患者体内分离出CD8+ T细胞克隆，定位了其识别的HLA-A11限制性ERVE-4衍生肽（CT-RCC-1），克隆了相应的全长T细胞受体（TCR），并证明ERVE-4靶向的TCR工程T细胞在体外和体内均能介导ccRCC肿瘤杀伤。这些发现推动了首个I期临床试验（NCT03354390），验证了转移性ccRCC患者接受ERVE-4特异性TCR转导T细胞过继治疗的可行性和安全性。
然而，HERVs的重复性质及家族内高度序列同源性持续挑战着HERVs的全面注释，并使得利用短读长下一代测序（NGS）平台进行准确转录本定位变得复杂。尽管基于短读长的RNA测序提供了有价值的见解，但它通常无法区分全长HERV转录本或解析新型异构体。相比之下，长读长测序技术能够跨越包括poly(A)尾在内的完整前病毒转录本，准确地将读段分配到其基因组位点，并揭示此前未被识别的剪接转录变体。然而，目前尚缺乏基于长读长测序的逆转录组分析标准化计算工具。本研究旨在利用长读长RNA测序改进HERV转录组注释，并系统表征ccRCC中的HERV转录组。
二、研究内容与结论
研究人员开发了一种用于PacBio Iso-Seq RNA测序并结合Telescope注释的生物信息学工作流程，系统且准确地表征了ccRCC中的HERV转录组。通过比较从ccRCC细胞系生成的Illumina短读长和PacBio长读长RNA测序数据集，研究人员发现长读长测序显著改善了比对分辨率，并揭示了数百个在相应短读长注释中缺失的HERV位点。重要的是，长读长RNA序列分析实现了HERV异构体的完整重建，这是仅凭短读长数据集无法实现的。值得注意的是，该方法发现了此前未分类的ERVE-4异构体，并通过RT-dPCR在众多ccRCC肿瘤中进行了验证。这些新定义的异构体拓宽了ERVE-4抗原景观，有望为肾癌未来的TCR和CAR-T免疫治疗提供独特的肽靶点。
三、关键技术方法
研究人员使用了11株不同的人ccRCC细胞系（RCC1–RCC11），均来自NIH临床中心手术切除的肿瘤。利用CRISPR-Cas9双sgRNA策略敲除了四株表达ERVE-4的ccRCC细胞系中的整个ERVE-4基因组区域，并通过CD19磁珠富集和单细胞分选获得纯合敲除克隆。RNA处理方面，提取总RNA后制备poly(A)选择mRNA文库，在Illumina MiSeq平台进行短读长测序（每样本约2000万双端读段），同时使用SMRTbell Prep Kit v3.0制备文库并在PacBio Sequel II平台进行Iso-Seq长读长测序。生物信息学分析中，使用IsoSeq3流程处理PacBio长读长数据，经CCS读段预处理、FLNC序列生成、聚类和Pigeon分类后比对至GRCh38参考基因组，并利用Telescope生成的HERV参考注释进行整合；短读长数据则通过RNA-seek流程处理，包括FastQC、Cutadapt、STAR两遍比对和RSEM定量。此外，针对ERVE-4-pol-2X-env转录本第二剪接位点周围区域设计了异构体特异性引物进行靶向PCR测序，并使用RT-dPCR（QIAcuity One平台）对四种ERVE-4异构体进行验证和定量。
四、研究结果
HERV转录组在三个ccRCC细胞系中保持一致
研究人员使用长读长（PacBio）RNA测序数据从三个独立ccRCC细胞系中组装和分类异构体，并使用短读长（Illumina）RNA测序数据定量HERV基因和异构体表达。在合并数据集中共鉴定182,504个全长转录本，每个单独ccRCC文库中组装超过90K转录本。排除GENCODE基因后，获得4,197个非冗余HERV转录异构体，其中99.07%（n=4,158）在三个ccRCC细胞系中表现出完全一致的外显子-内含子连接模式。长读长异构体表现出更高的唯一比对读段百分比（95%–97%），而短读长比对为83%–85%。该流程在每个样本中鉴定出2,978–3,257个HERV转录本，归属于961–986个HERV位点，其中678–689个为Bendall等人先前在正常组织和除ccRCC外的多种肿瘤中描述的。相比之下，短读长RNA测序在三个ccRCC细胞系中鉴定出1,428–1,497个HERV转录本，来自618–635个HERV位点。总体而言，长读长RNA测序数据中发现了1,400–1,613个HERV转录本和286–326个HERV位点，这些在短读长测序平台中完全未被检测到。值得注意的是，短读长数据中检测到的所有HERV转录本均包含在长读长数据集中。长读长RNA测序共鉴定出1,034个在至少一个ccRCC细胞系中表达的独特HERV。
新型ERVE-4转录变体的发现
研究人员聚焦于ERVE-4，在三个细胞系中发现了四种全长ERVE-4转录本，包括三个单剪接和一个双剪接变体。序列比较显示，所有新型转录本与先前鉴定的CT-RCC-8、CT-RCC-9和CT-RCC-Env转录本具有相同的5′LTR区域剪接供体位点（SD1）。四种异构体中一种代表先前已知的CT-RCC-Env转录本，其余三种为新型ERVE-4转录变体。三个单剪接变体编码pol基因的不同部分和整个env基因。新型ERVE-4-pol-env-A变体覆盖pol基因的主要部分以及env基因序列。新鉴定的ERVE-4-pol-env-B转录本比CT-RCC-Env转录本在pol基因3′部分长18个核苷酸。最长且双剪接的转录变体编码gag基因的一小段3′区域、完整的pro和pol基因以及部分截短的env基因。所有四种转录本均以相同阅读框编码开放阅读框（ORFs）。新型ERVE-4-pol-env-A和双剪接转录本ERVE-4-pol-2X-env与先前已知的ERVE-4转录本相比，在gag、pro和pol基因中具有额外的编码能力。
通过RT-dPCR验证新型ERVE-4转录本在ccRCC细胞系中的表达
研究人员使用四种定制引物-探针检测方法，特异性地检测四种ERVE-4异构体中先前描述的（SD1/SA1和SD1/SA2）和新鉴定的（SD1/SA3和SD1/SA4）剪接连接。作为特异性对照，纳入了通过CRISPR/Cas9删除整个ERVE-4位点的ERVE-4阴性ccRCC细胞系。RT-dPCR结果显示，所有三个亲本野生型ccRCC细胞系均产生稳健的异构体特异性信号，而所有ccRCC ERVE-4敲除变体中均未检测到扩增，确认了所有检测方法的高特异性。研究进一步将验证扩展到另外九个ccRCC细胞系（ccRCC4–ccRCC11），尽管不同细胞系间ERVE-4表达水平存在差异，但所有九个野生型细胞系中均一致检测到所有四种异构体，而在ccRCC4 ERVE-4敲除中未检测到，提供了这些异构体在不同ccRCC肿瘤中普遍表达的强有力证据。有趣的是，相对异构体丰度在肿瘤来源细胞系间存在差异。在11个细胞系中的5个（ccRCC2、ccRCC3、ccRCC7、ccRCC10和ccRCC11）中，所有四种异构体以相似比例表达，而其余6个细胞系表现出不同的表达模式，某些异构体占主导地位。这些数据表明，不同ccRCC肿瘤不仅表达多种ERVE-4剪接变体，而且在相对异构体使用上也存在差异，反映了ERVE-4剪接调控的异质性。
五、讨论与结论
据研究人员所知，这是第一项将长读长RNA测序应用于癌细胞中HERV转录组分析的研究，凸显了长读长技术在研究内源性逆转录病毒转录景观方面的更广泛优势。短读长方法常丢弃多比对读段或错误分配重复片段，导致对众多HERV表达的低估。研究人员将Telescope这一基于贝叶斯框架的广泛使用的HERV注释工具扩展到长读长RNA测序数据中。与Bendall等人使用Telescope分析ENCODE项目短读长RNA测序数据不同，研究人员将其应用于ccRCC细胞的长读长数据，扩展了此前描述的基因组范围细胞类型特异性HERV图谱，检测到众多具有ccRCC肾癌特异性表达的额外HERV元件。在肾癌中检测到的再激活HERV元件数量增加，可能反映了长读长测序增强的检测能力，以及ccRCC作为高度免疫原性肿瘤类型可能表达比其他癌症更广泛的HERV元件库。长读长测序可能引入截短转录本捕获失败或重复HERV位点内模糊比对等伪影，因此研究人员对稀有异构体谨慎解读，对在不同样本中可重复检测并受独立短读长RNA测序支持的转录本赋予更高置信度。
先前研究表明，即使HERVs中保留的短ORFs也能产生免疫原性肽。在此背景下，研究人员对新型ERVE-4转录本的鉴定提供了该位点抗原库的更完整视图。鉴于其在ccRCC中的限制性表达，这些转录本可能代表肾癌免疫治疗的有力候选靶点。研究人员还观察到同一HERV位点衍生异构体在ccRCC细胞系间相对丰度的变异性，这可能反映肿瘤特异性剪接或转录稳定性调控，改变肿瘤抗原谱和肿瘤免疫原性。从免疫治疗角度看，这种异质性既带来挑战也带来机遇，可能需要根据显性肿瘤特异性异构体谱制定不同的靶向策略，同时为优先靶向显性异构体衍生的肿瘤抗原提供了机会。
ERVE-4在约90%的ccRCC中选择性表达、正常组织中缺失、并编码T细胞可识别的抗原。研究人员克隆了靶向HLA-A11限制性ERVE-4衍生肽的TCR，并证明TCR工程T细胞在体外和体内介导ccRCC肿瘤的特异性杀伤，推动了首个HERV定向TCR基因治疗转移性肾癌的人体临床试验。然而，HLA-A11在许多人群中的有限流行率凸显了识别由更常见HLA等位基因呈递的额外肽的必要性。Lu等人（2021）开发了基于深度学习的pMHC-TCR结合预测网络（pMTnet），发现ERVE-4在所有HERVs中表现出最高的肿瘤与正常组织表达比，且ERVE-4衍生抗原在ccRCC中的免疫原性超过新抗原和其他自身抗原。
总之，本研究确立了长读长RNA测序作为HERV转录组分析的优越方法，其跨越全长转录本的能力克服了短读长测序因HERV序列重复性而受损的比对分辨率限制。具体而言，长读长数据使得发现此前未识别的ERVE-4转录变体成为可能。未来识别新型ERVE-4衍生抗原及其特异性TCR和抗体的努力，对于将这些转录组学见解转化为肾癌临床可行的TCR和CAR治疗至关重要。
