《Frontiers in Immunology》：Immune-evading universal donor iPSC-derived natural killer cells enable off-the-shelf cancer immunotherapy
编辑推荐：
背景： 自然杀伤细胞因其内在的清除恶性细胞能力和安全性而成为癌症免疫治疗的一种有前景的方式，但其临床应用仍受限于供体变异性、免疫排斥和大规模生产的挑战。
方法： 研究人员开发了一个多基因编辑的通用供体诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞平台。首先，通过破坏
背景： 自然杀伤细胞因其内在的清除恶性细胞能力和安全性而成为癌症免疫治疗的一种有前景的方式，但其临床应用仍受限于供体变异性、免疫排斥和大规模生产的挑战。
方法： 研究人员开发了一个多基因编辑的通用供体诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞平台。首先，通过破坏B2M和RFXANK以消除HLA I类和II类分子，并引入单链HLA-E以实现免疫逃逸，从而生成工程化的iPSC系。此外，还整合了一个安全开关系统以确保可控性。研究人员还开发了一种新型的无饲养层、可规模化生产工艺，用于制备冷冻保存的UDC-NK细胞，以实现现货型细胞治疗。
结果： 研究人员成功生成了大量具有活化表型的UDC-NK细胞。UDC-NK细胞在体外对CD20+淋巴瘤细胞系表现出强大的细胞毒性和细胞因子产生能力，且在利妥昔单抗存在下这些能力进一步增强。UDC-NK细胞有效展示了对同种异体T细胞和NK细胞介导反应的免疫逃逸。此外，在体外，基于单纯疱疹病毒胸苷激酶的安全开关可通过更昔洛韦处理选择性清除UDC-NK细胞。在播散性B细胞淋巴瘤模型中，UDC-NK细胞与利妥昔单抗联合治疗实现了近乎完全的肿瘤生长抑制，并显著延长了生存期。
结论： 这些发现确立了UDC-NK细胞作为一种可规模化的现货型细胞治疗平台，具有增强的抗肿瘤疗效和内置的安全性控制，支持其在联合抗体类癌症疗法中的潜在临床应用。
一、研究背景与科学问题
近年来，癌症免疫治疗取得了飞速发展，已成为继手术、化疗、靶向治疗和放疗之后的又一重要支柱。其中，自体嵌合抗原受体T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成效，但其临床应用受到诸多限制：个体化生产流程复杂、成本高昂、制备周期长，可能延误病情快速进展患者的治疗；患者来源起始材料的差异导致产品变异，影响疗效一致性；此外，自体T细胞疗法还可能引发严重的细胞因子释放综合征和神经毒性等不良反应。因此，开发一种可规模化、标准化、随时可用的现货型细胞治疗平台成为领域内的迫切需求。
自然杀伤细胞作为固有免疫淋巴细胞，无需抗原特异性预敏即可通过激活与抑制性受体信号的平衡识别恶性细胞，尤其能识别因下调主要组织相容性复合体分子而发生“自我缺失”的转化细胞。NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶、死亡受体途径以及分泌干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α等多种机制发挥抗肿瘤作用，还能通过Fc受体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与治疗性单克隆抗体协同作用。然而，原代NK细胞同样面临供体间变异性大、扩增潜力有限、大规模生产困难、输注后持久性差以及对冻存敏感等问题。
诱导多能干细胞为解决上述难题提供了理想策略。iPSC具有无限自我更新能力，可分化为包括NK细胞在内的多种细胞类型，并能从特征明确的种子细胞库中规模化生产标准化产品。更重要的是，iPSC为在干细胞阶段进行多重基因工程改造提供了平台，可引入增强疗效、持久性和安全性的多种遗传修饰。近期发展的通用供体iPSC技术通过腺相关病毒介导的基因编辑，破坏B2M和RFXANK基因以消除HLA I类和II类分子表面表达，同时引入单链HLA-E构建体，使UDC及其分化衍生物既能逃避宿主T细胞识别，又能避免NK细胞介导的排斥反应，有望实现无需HLA配型的广泛兼容性异体细胞治疗。
基于上述背景，本研究旨在开发一种整合免疫逃逸、增强ADCC能力和内置安全开关的多基因编辑通用供体iPSC来源的NK细胞平台，并建立无饲养层、可规模化的生产工艺，评估其抗肿瘤效力与安全性。
二、关键技术方法
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）利用重组腺相关病毒对野生型iPSC系NIH3 c.C4进行多轮基因编辑，依次敲除B2M和RFXANK基因以消除HLA I类和II类分子表达，引入单链HLA-E嵌合受体以防止CD94/NKG2A阳性异体NK细胞介导的排斥，整合更昔洛韦诱导的胸苷激酶基因盒作为安全开关，并引入编码高亲和力CD16A F158V天然变体的FCGR3A基因以增强ADCC，最终建立UDC-iPSC克隆NIH3 c.7C2并建立GMP种子库；2）开发三步法无饲养层NK细胞分化工艺：将UDC-iPSC接种于AggreWell板形成拟胚体，经14天造血分化获得CD34+造血祖细胞；将HPC转移至RetroNectin和Delta样配体4包被的培养皿，在含细胞因子鸡尾酒和小分子UM171的条件下进行21天NK定向分化；收获未成熟CD56+ UDC-NK细胞后，在抗NKp30和抗DNAM-1抗体包被的培养皿中激活3天，随后转入搅拌瓶在IL-15和IL-18存在下扩增4天，重复三个循环共21天完成活化扩增；3）采用流式细胞术分析细胞表型和HLA分子表达；4）利用HiBiT检测系统和IncuCyte活细胞成像系统分别评估自然细胞毒性和ADCC活性；5）采用DELFIA细胞毒性实验和CellTiter-Glo活力测定评估免疫逃逸和安全开关功能；6）在缺乏小鼠Fc受体但表达人IL-15的NOGF-IL-15免疫缺陷小鼠中建立播散性Raji-Luc和Daudi-Luc B细胞淋巴瘤模型，通过生物发光成像监测肿瘤负荷和生存期。
三、研究结果
3.1 建立带有安全开关和稳定高亲和力FcR表达的通用供体iPSC系用于NK细胞生产
研究人员通过AAV介导的基因编辑技术，在UDC-iPSC基础上进一步引入更昔洛韦诱导的胸苷激酶安全开关和高亲和力FCGR3A F158V变体，建立了用于NK细胞生产的iPSC克隆NIH3 c.7C2。该克隆均匀表达OCT4、SOX2和SSEA-3/4等多能性标志物，表明维持了多能性状态。
3.2 建立高效、可规模化、无饲养层的UDC-NK细胞生产工艺
研究人员开发了包含14天HPC分化、21天NK分化和21天活化扩增的三步法生产工艺，总时长56天。在活化扩增阶段，每个7天周期可实现约10倍扩增，三个连续周期后总扩增超过1000倍。收获时细胞纯度>99%为CD45+CD3-CD56+ NK细胞。表型分析显示，UDC-NK细胞保留了工程化基因型特征——持续表达HLA-E且缺乏HLA I类和II类分子；表达自然细胞毒性受体NKp30、NKp44、NKp46以及激活受体DNAM-1、NKG2D、CD2和2B4；表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体表明已成熟；高表达TRAIL、穿孔素和颗粒酶B等效应分子；PD-1和TIGIT等抑制性受体表达极低。
3.3 冷冻保存UDC-NK细胞的全面功能表征
解冻后的UDC-NK细胞立即对K562细胞表现出强效自然细胞毒性。在与表达NucLight Red的CD20+ Ramos细胞共培养时，UDC-NK细胞展现出强大的细胞毒性，且在利妥昔单抗存在下进一步增强。在K562或利妥昔单抗包被的Raji细胞刺激下，UDC-NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平显著升高。在反复肿瘤细胞攻击实验中，UDC-NK细胞表现出持续的系列杀伤活性，利妥昔单抗处理后系列ADCC活性更为强劲。针对多种CD20+非霍奇金淋巴瘤细胞系的ADCC实验均证实了广泛的抗肿瘤活性。
3.4 系列活化/扩增过程中UDC-NK细胞的表型和功能变化
经过长达七轮共49天的连续活化扩增，UDC-NK细胞仍持续增殖，累计扩增约109倍。流式分析显示DNAM-1、NKG2D和CD25表达增加，TIGIT始终不可检测，CD2阳性细胞频率随时间上升。细胞毒性活性在整个扩增期内得以维持，IFN-γ产生呈增加趋势。
3.5 UDC-NK细胞对同种异体T细胞和NK细胞的免疫逃逸
在异体NK细胞介导的细胞毒性实验中，UDC-NK细胞完全抵抗裂解，而缺乏HLA-E表达的B2M敲除细胞则高度易感。在T细胞增殖实验中，UDC-NK细胞不诱导CD4+或CD8+ T细胞增殖，而野生型iPSC来源的NK细胞则刺激了强烈的同种异体T细胞增殖。
3.6 引入单纯疱疹病毒胸苷激酶安全开关
表达HSV-TK的UDC-NK细胞在更昔洛韦处理下以剂量依赖方式被高效清除，在临床相关浓度下被完全消除，而野生型iPSC-NK细胞活力无明显变化。
3.7 UDC-NK细胞联合利妥昔单抗在B细胞淋巴瘤异种移植模型中的疗效
在NOGF-IL-15小鼠中，冷冻保存的UDC-NK细胞输注后第3天在外周血中检出频率最高，第7天下降，小鼠出现短暂体重减轻但完全恢复。在Raji播散性淋巴瘤模型中，利妥昔单抗单药仅适度抑制肿瘤进展，而UDC-NK细胞与利妥昔单抗联合治疗实现了约99%的肿瘤抑制率，并显著延长生存期。在Daudi播散性淋巴瘤模型中同样观察到联合治疗的强效抗肿瘤活性，肿瘤生长抑制率达99%，生存期显著改善。
四、讨论与结论总结
讨论部分核心要点：
异体NK细胞疗法因其内在的肿瘤识别能力和良好的安全性正成为T细胞免疫治疗的有前景替代方案。本研究开发的UDC-NK平台通过多重基因编辑整合了免疫逃逸、增强ADCC和内置安全开关。值得关注的是，研究建立了无饲养层的生产工艺，利用抗NK激活受体激动剂配合细胞因子鸡尾酒实现了大规模扩增，避免了传统饲养层系统的复杂性。中央组成部分是多基因编辑的通用供体iPSC系：B2M和RFXANK敲除消除了HLA I类和II类分子表达以阻止T细胞识别，单链HLA-E引入提供了对NK细胞介导细胞毒性的保护。研究证实UDC-NK细胞不激活异体T细胞并对异体NK细胞裂解具有抵抗力。HSV-TK安全开关在更昔洛韦作用下实现了高效的体外清除。高亲和力FCGR3A F158V变体的均匀表达增强了ADCC，在体内转化为显著的治疗获益——在缺乏Fc受体的NOGF-IL-15小鼠模型中，联合利妥昔单抗几乎完全抑制了肿瘤进展并显著延长生存期。研究也指出了局限性：未与CD16未修饰的iPSC-NK细胞直接比较ADCC活性，未系统评估UDC-NK单药治疗的体内贡献，未与原代NK细胞或未编辑iPSC-NK细胞进行头对头比较。未来可通过引入CAR、膜结合IL-15或破坏CISH等抑制通路进一步优化平台。
结论翻译：
总之，研究人员开发了一个通用供体iPSC来源的NK细胞平台，该平台在一个无饲养层、可规模化的生产框架内整合了免疫逃逸、增强的ADCC能力和诱导性安全开关。由多基因编辑的UDC-iPSC生产的UDC-NK细胞在体外和体内均展现出强效的抗肿瘤活性，特别是在与利妥昔单抗等抗体类疗法联用时尤为突出。这些发现支持UDC-NK细胞作为下一代现货型NK细胞疗法用于血液系统恶性肿瘤乃至实体瘤的潜力。
