《Frontiers in Fungal Biology》：Draft genome sequence and phenotypic analysis of Pseudozyma sp. SY16 with evidence of binucleate cells
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甘露糖赤藓糖醇脂（Mannosylerythritol lipids, MELs）是一种糖脂类生物表面活性剂（glycolipid biosurfactants），因其良好的生物相容性和稳定性，在化妆品和工业应用中受到广泛关注。Pseudozyma sp. S
甘露糖赤藓糖醇脂（Mannosylerythritol lipids, MELs）是一种糖脂类生物表面活性剂（glycolipid biosurfactants），因其良好的生物相容性和稳定性，在化妆品和工业应用中受到广泛关注。Pseudozyma sp. SY16是一株具有高产能力的潜力MEL生产菌株；然而，基因组资源的缺乏限制了对其遗传和细胞特征的认识，并阻碍了其在代谢工程中的应用。本研究采用长读长与短读长测序相结合的杂合测序策略，生成了Pseudozyma sp. SY16的高质量基因组草图，并全面表征了其基因组与细胞特征。该20.2 Mb的基因组被组装为23个核支架（nuclear scaffolds）和1个线粒体支架（mitochondrial scaffold），BUSCO完整度高达98.9%。对Ustilaginaceae科内近缘物种间MEL生物合成基因的比较分析揭示了不同的基因保守模式。mac1、mac2、mat1、mmf1和emt1基因在SY16、P. hubeiensis和Mycosarcoma maydis中于基因内容和基因组组织上均高度保守，而在P. pruni和P. flocculosa的相应区域中仅mmf1被保留。该模式提示MEL生物合成基因在Ustilaginaceae科进化过程中发生了谱系特异性的保留与丢失。GenomeScope分析显示以单峰为主的k-mer分布，未见明确指示单倍体或二倍体基因组的模式。另一方面，共聚焦显微镜观察发现，频繁出现含两个空间上分离的DAPI阳性信号的细胞，与明显的双核（binucleate）形态相一致。综上，这些发现为SY16建立了高质量的基因组资源，并为MEL生物合成、基因组进化和细胞组织提供了新见解，为未来对该非模式酵母进行遗传和代谢工程改造以提高MEL产量奠定了基础。
**研究背景与问题**
生物表面活性剂（biosurfactants）是主要来源于微生物的生物源性表面活性化合物，因高生物降解性、低毒性和环境可持续性，被视为传统合成表面活性剂的可持续替代品。动物源表面活性剂存在动物使用伦理及与食物资源竞争等问题；植物源表面活性剂虽成本较低且易得，但受气候与环境条件影响，原料供应稳定性及标准化困难。微生物生物表面活性剂可在受控发酵条件下生产，且生产菌株易于通过代谢和遗传工程改造，因而受到广泛关注。在鼠李糖脂（rhamnolipids）、槐糖脂（sophorolipids）和甘露糖赤藓糖醇脂（MELs）等代表性糖脂类生物表面活性剂中，鼠李糖脂和酸性槐糖脂为阴离子型表面活性剂，其理化性质受pH影响，且阴离子性质可能引起皮肤刺激；鼠李糖脂生产传统上依赖机会致病菌P. aeruginosa，存在安全性顾虑。相比之下，MELs为非离子型糖脂，皮肤相容性好，在宽pH和温度范围内稳定性好，可由非致病酵母在受控发酵条件下高效生产，其结构多样性还可通过改变脂肪酸组成和乙酰化模式进行性质定制。Pseudozyma属菌株被认为是MELs的有前景生产者，但MELs的工业商业化仍相对有限。Pseudozyma sp. SY16已被报道具有高MEL产率，有作为工业生产宿主的潜力，但与其相比，SY16的公开基因组资源有限；已有多个Pseudozyma及相关物种的基因组组装报道，但许多仍较碎片化或注释不完整，限制了比较基因组和功能分析。因此，本研究旨在构建Pseudozyma sp. SY16的高质量全基因组组装，开展全面的结构与功能注释和比较基因组分析，并利用共聚焦显微镜考察其细胞形态与核组织，辅以全基因组杂合性分析，为MEL生物合成、遗传操作和代谢工程研究奠定基础。
**主要关键技术方法**
研究人员采用PacBio Sequel与Illumina HiSeq杂合测序策略，以分层基因组组装流程（HGAP）进行de novo组装，并用Quiver及Pilon v1.21抛光纠错；利用MAKER v2.31.8流程进行结构基因预测，BLAST+比对NCBI NR/NT数据库进行功能注释；以BUSCO v5.8.3（basidiomycota_odb10）评估基因组完整度，MitoHiFi v3.2.2注释线粒体基因组；基于Jellyfish v2.2.6的21-mer谱和GenomeScope 2.0分析基因组大小与杂合度；采用antiSMASH v8.0.4和dbCAN3预测生物合成基因簇（BGCs）与碳水化合物活性酶（CAZymes）；以OrthoFinder v2.5.4、OrthoVenn3和Clinker v0.0.32开展直系同源与MEL基因簇共线性比较；结合扫描电镜（SEM）、DAPI染色共聚焦显微镜及ITS序列系统发育分析进行形态与分类学表征。菌株SY16原分离自韩国大田石油污染土壤样品。
**研究结果**
3.1 Pseudozyma sp. SY16的细胞特征与二态性形态：通过SEM和光镜观察及平板培养，发现SY16在YM平板上早期形成黏稠淡黄色菌落，随时间沿菌落边缘出现假菌丝扩展，分离假菌丝区域继代培养后稳定保持假菌丝形态而不回复原菌落形状，表明存在不可逆的相变；显微观察证实 daughter cells 出芽后仍附着于母细胞并持续极性伸长形成链状结构。在含甘油和油酸的特定培养基中，野生型菌株MEL产量达22 g/L。
3.2 SY16的基因组组装与基因组特征：通过杂合组装获得总长20,223,705 bp的基因组，仅分布于23个核支架和1个线粒体支架，N50为894.2 kb，GC含量53.5%，显著优于高度碎片化的P. tsukubaensis NBRC 1940基因组（23.8 Mb、12,840个支架）；BUSCO分析显示98.9%为完整基因，其中98.8%为单拷贝、仅0.1%为重复。k-mer（k=21）谱经GenomeScope分析虽在数学上最符合二倍体模型（p=2），但缺乏典型双峰模式，仅见约77×覆盖度的单一主峰，模型估计基因组组成为73.3%纯合（aa）和26.7%杂合（ab），提示SY16不太可能是典型单倍体，需进一步细胞学验证。线粒体基因组为约39,750 bp的环状基因组，编码rrnS、rrnL、atp6、8、9、细胞色素B、cox 1–3、nd1–6和nd4l、rps 3及22个tRNA基因。
3.3 系统发育定位与比较基因组学：基于ITS序列的系统发育分析显示SY16与P. tsukubaensis NBRC 1940聚于同一单系分支，全基因组ANI值为98.3%，支持将SY16鉴定为P. tsukubaensis。直系同源蛋白聚类显示，SY16的直系同源群数量最多（6,009个），P. flocculosa PF-1最少（5,442个）；六个基因组共37,953个预测基因中36,963个（97.4%）归入6,397个直系同源群，4,603个直系同源簇为六物种共享；SY16含6个物种特异簇，均缺乏信息性GO注释；共鉴定99个物种特异直系同源群（328个基因）和3,909个单拷贝直系同源群。
3.4 MEL生物合成基因簇：通过clinker共线性分析，在P. hubeiensis SY62和M. maydis 521的共线区域中鉴定到全部5个MEL生物合成基因，其相对位置和方向与SY16基本保守，同源基因序列一致性分别为48%–70%和52%–69%；而在P. pruni CBS 10937和P. flocculosa PF-1的相应共线区域中仅鉴定到mmf1，且其同源序列一致性较低（36%–41%），提示该基因被保留而其余MEL生物合成基因发生较大分化或丢失。
3.5 基因组注释与交配型表征：6,334个预测蛋白编码基因中，6,323个具有含起始和终止密码子的完整编码序列。CAZymes鉴定共获得115个糖苷水解酶（GH）、67个糖基转移酶（GT）、27个辅助活性（AA）、14个碳水化合物酯酶（CE）、4个碳水化合物结合模块（CBM）和2个多糖裂解酶（PL），无扩展蛋白（EXP）；GH中GH18最丰富（占CAZymes的8.8%），其次为GT2（8.0%）。antiSMASH鉴定到12个推定次级代谢产物BGCs，其中萜烯簇与已知clavaric acid基因簇相似性达97%，一个NRPS-like簇与已知胆碱相关位点相似性达100%。BLASTP在SY16基因组中鉴定到交配型基因bE1和bW1的同源物，提示其含有b交配型位点的核心遗传组分。
3.6 共聚焦显微镜揭示的核组织：通过DAPI染色和共聚焦显微镜，频繁观察到含两个明显DAPI染色核信号的细胞，约50%的受检细胞呈双核样形态；分裂中的细胞亦可见两个核信号，包括两核似处于分裂状态的细胞。交配型位点仅含bE1和bW1，未鉴定到其他bE或bW等位基因，不足以支持同一细胞内存在两个遗传上不同的交配型核。结合GenomeScope推断的显著杂合组分与频繁双核细胞的观察，提示SY16的核组织可能比常规单倍体或二倍体酵母更复杂，所观察到的两个核可能代表与细胞周期相关的瞬时双核状态，需核特异性基因组分析或等位基因特异性测序进一步确定两核间的遗传关系及倍性。
**讨论与结论**
讨论指出，杂合组装显著改善的连续性为比较基因组学和功能研究提供了可靠框架，ITS系统发育及98.3%的ANI支持SY16归属P. tsukubaensis；鉴于近期分类学修订将若干Pseudozyma物种归入Moesziomyces等属，研究人员依历史文献暂称其为Pseudozyma sp. SY16（隶属于P. tsukubaensis）。全基因组直系同源聚类显示高度保守，但MEL生物合成位点的进化模式并不完全遵循全基因组系统发育关系——P. flocculosa在系统发育树中最为分化，P. pruni则相对接近SY16，然而MEL基因的保守分布却与之不一致，提示该位点的进化史可能由谱系特异性过程（差异基因保留、基因丢失、序列分化或基因组重排）塑造。SY16、P. hubeiensis和M. maydis中五个MEL基因于共线区域内的保留提示其可能作为功能相关的生物合成模块被维持；P. pruni和P. flocculosa中mmf1的保留提示该基因可能受不同进化约束，而P. flocculosa不产MELs的已有表型与其基因组观察高度一致。这些差异也可能与MELs的生态功能相关，即在特定环境条件下提供适合度优势而利于通路保留。完整的MEL基因组合本身不足以完全解释SY16的高产性状，转录调控、前体可用性、脂肪酸代谢、脂质转运及对疏水底物的细胞响应等可能共同影响生物合成输出。基因组注释还揭示了SY16广泛的代谢谱，包括多样的CAZymes和12个推定次级代谢产物BGCs，GH18和GT2的高比例提示其在环境碳水化合物降解和细胞壁相关多糖合成方面的潜力。关于核组织，GenomeScope显示的显著杂合组分（26.7%）可能反映重复染色体/核间的序列分化或重复区域与片段重复所致的技术性假象；双核的存在本身不能确立常规双核体状态，单一bE1/bW1等位基因组合且无其他bE或bW等位基因的证据不支持由两个遗传上不同的交配型核组成的典型双核体，SY16可能经历多核或瞬时双核状态。该核表型与SY16的形态发育相关值得关注，但当前观察未建立二者间的直接关系。在遗传工程方面，研究人员以潮霉素抗性基因作为选择标记的初步基因破坏试验中，转化子常同时携带野生型和破坏序列，提示在双核背景下基因组编辑可能仅发生于部分核或基因组拷贝，从而可能解释同一菌落或细胞谱系中野生型与编辑序列共存，并可能增加获得遗传均一敲除菌株的难度。总之，本研究证明SY16不仅是具有良好保守生物合成位点的高产MEL酵母，也是遗传和细胞上独特的Pseudozyma菌株，拓宽了对其生物学特征的认识，并为改进其作为非模式微生物生产宿主提供了基因组基础。
研究结论（翻译）：综上，这些发现为SY16建立了高质量的基因组资源，并为MEL生物合成、基因组进化和细胞组织提供了新见解，为未来对该非模式酵母进行遗传和代谢工程改造以提高MEL产量奠定了基础。
