《Frontiers in Microbiology》：S100A4 facilitates influenza A virus replication by interacting with M2 in human alveolar epithelial cells
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甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）的复制依赖于宿主细胞，并受到众多宿主因子的调控。因此，研究并认识这些宿主因子的作用是一个重要课题。本研究中，研究人员发现，通过RNAi敲低或CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除宿主因子S100钙结合
甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）的复制依赖于宿主细胞，并受到众多宿主因子的调控。因此，研究并认识这些宿主因子的作用是一个重要课题。本研究中，研究人员发现，通过RNAi敲低或CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除宿主因子S100钙结合蛋白A4（S100A4）后，IAV复制减弱；反之，在A549细胞中过表达S100A4则增强IAV复制。通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）确认S100A4与IAV M2蛋白之间存在相互作用。此外，激光共聚焦显微镜实验表明，在IAV感染的A549细胞中，病毒M2蛋白与内源性S100A4共定位。截短分析证实M2蛋白第45–62位氨基酸构成与S100A4相互作用的主要区域。进一步研究发现，S100A4缺失后病毒进入减少；与野生型A549细胞相比，S100A4敲除A549细胞中的聚合酶活性显著下降。S100A4过表达导致IFN-β下调，且干扰素刺激基因ISG15和BST2的mRNA水平也显著降低。因此，宿主因子S100A4是IAV复制的正向调节因子，参与病毒进入、聚合酶活性维持及固有免疫调控。总之，这些发现为认识IAV感染的分子机制提供了新视角，并提出了一条此前未被充分探索的抗病毒治疗干预途径。
甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）是分节段负链RNA病毒，基因组约13 kb，可感染禽类、猪、马以及海豹、奶牛和人等多种哺乳动物，并曾引起1918年（H1N1）、1957年（H2N2）、1968年（H3N2）和2009年（H1N1）多次大流行。禽流感病毒如H7N9、H5N1等也可通过人畜共患传播威胁人类健康。现有防控手段以疫苗和抗病毒药物为主，但流感疫苗因抗原漂移和疫苗株与流行株不匹配而效力下降；M2离子通道阻滞剂金刚烷胺、神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和PA核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦也都已出现耐药突变。由于IAV复制高度依赖宿主细胞，寻找并鉴定新的宿主因子可为抗流感药物研发提供潜在靶点。M2蛋白是IAV的表面离子通道，在病毒脱壳、膜融合、组装和出芽中发挥关键作用，已发现TRAPPC6A、RAB33B、LC3、YWHAG、PEX19、UBR4等多种宿主因子可与M2互作并促进或限制病毒复制。S100A4是一种钙结合蛋白，参与肿瘤转移、纤维化和炎症反应，近年在病毒感染和抗病毒免疫中的作用逐渐受到关注，但S100A4是否影响流感病毒复制尚不清楚。因此，研究人员以人肺腺癌上皮细胞A549为模型，系统研究了S100A4对IAV复制的影响及其分子机制。
研究人员在A549细胞中通过RNAi敲低和CRISPR/Cas9敲除S100A4，发现IAV复制受到抑制；稳定过表达S100A4则增强病毒复制。机制上，S100A4与病毒M2蛋白相互作用，M2蛋白第45–62位氨基酸是结合关键区域；S100A4参与病毒进入和聚合酶活性的维持，并抑制IFN-β及干扰素刺激基因ISG15、BST2的表达。这些发现将S100A4鉴定为一个新的促流感病毒宿主因子，为理解IAV复制机制和开发宿主导向的抗病毒策略提供了依据。
关键方法技术：细胞来源为ATCC的人肺癌肺泡基底上皮细胞A549（CCL-185）、人胚肾细胞HEK293T（CRL-3216）和犬肾细胞MDCK（CCL-34）；病毒包括反向遗传拯救的A/WSN/1933（H1N1）和PR8-NS1-R38A/K41A。主要技术包括：RNAi小干扰RNA敲低、CRISPR/Cas9敲除、稳定过表达细胞株构建、免疫共沉淀与Western blot验证蛋白互作、激光共聚焦免疫荧光检测共定位、WSN PB2-KO/Rluc单轮复制报告病毒检测早期感染事件、微型基因组（minigenome）实验检测聚合酶活性、ELISA和qRT-PCR检测IFN-β及ISG15/BST2表达。
3.1 S100A4对于甲型流感病毒在A549细胞中的增殖是必需的。通过三条S100A4特异性siRNA敲低S100A4，qRT-PCR和Western blot确认敲低效率，CCK-8实验显示细胞活力不受影响；WSN病毒感染后48 h，病毒产量显著低于siNC对照。CRISPR/Cas9敲除S100A4的单细胞克隆经测序确认外显子2发生单碱基胸苷缺失并导致移码，Western blot确认蛋白表达缺失；多周期生长实验显示病毒滴度和M2蛋白积累显著下降。这表明S100A4是A549细胞中IAV有效增殖所必需的宿主因子。
3.2 S100A4表达升高增强甲型流感病毒在A549细胞中的增殖。通过稳定转染pIRES-S100A4-Flag构建S100A4过表达A549细胞，Western blot确认S100A4蛋白水平升高；感染WSN病毒后48 h，病毒滴度和M2蛋白表达均高于空载体对照，细胞活力无显著差异。这表明S100A4过表达可促进IAV复制。
3.3 S100A4通过M2蛋白第45–62位残基与甲型流感病毒M2蛋白相互作用。在HEK293T细胞中共表达Flag标记的M2和Myc标记的S100A4，双向免疫共沉淀显示二者可相互沉淀；感染WSN病毒（MOI=10）8 h的A549细胞中，激光共聚焦显示M2与内源性S100A4在细胞质中共定位。截短突变分析发现，缺失第45–62位氨基酸后M2与S100A4的相互作用消失。这表明M2蛋白第45–62位是介导二者结合的关键区域。
3.4 S100A4参与流感病毒复制的早期阶段。使用PB2缺失、携带Renilla荧光素酶报告基因的复制缺陷型病毒WSN PB2-KO/Rluc感染野生型和S100A4敲除A549细胞（MOI=1），8 h后检测荧光素酶活性。与野生型细胞相比，S100A4敲除使报告活性降低40%–50%，与金刚烷胺阳性对照处理的效果相似。这表明S100A4正向调控IAV生命周期中的早期复制事件，包括病毒进入和脱壳相关过程。
3.5 S100A4缺失减弱甲型流感病毒聚合酶活性。在野生型和S100A4敲除A549细胞中共同转染WSN病毒的PB2、PB1、PA、NP四个聚合酶亚基表达质粒以及表达萤火虫荧光素酶的病毒样RNA报告质粒，并以Renilla荧光素酶为内参。双荧光素酶报告实验显示，S100A4缺失使IAV聚合酶活性显著降低。这表明S100A4对于维持IAV聚合酶活性具有重要作用。
3.6 S100A4抑制流感病毒感染后的干扰素产生。空载体对照和S100A4过表达A549细胞以MOI=1感染PR8-NS1-R38A/K41A病毒，该病毒可诱导干扰素产生。感染24 h后，ELISA检测显示S100A4过表达细胞上清中IFN-β水平显著低于对照组；qRT-PCR检测显示ISG15和BST2的mRNA水平也显著降低。这表明S100A4可抑制IAV感染诱导的I型干扰素应答。
讨论部分进一步分析了S100A4促病毒作用的可能机制。M2蛋白第45–62位残基形成两亲性α-螺旋，该区域已知可诱导膜弯曲并介导不依赖ESCRT（内体分选转运复合体）的膜分裂，可能为S100A4提供物理结合界面。S100A4本身具有膜和细胞骨架调节功能，可能被M2招募作为膜重塑的辅助因子。M2在高尔基体反面网络（trans-Golgi network, TGN）中利用质子通道活性维持区室pH，S100A4经内质网–高尔基体途径分泌，二者在TGN中的共定位可能为病毒组装和出芽提供有利空间条件。在聚合酶层面，M2通过抑制自噬-溶酶体融合并激活AKT-mTOR信号稳定聚合酶，S100A4则可能通过调节细胞骨架促进病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoprotein, vRNP）向细胞核运输，并通过抑制干扰素产生间接维持聚合酶活性。在固有免疫层面，M2可经MAVS和cGAS/DDX41–STING途径调节IFN-β，S100A4可以钙依赖性方式结合IFN-β并抑制其效应；二者相互作用可能协同抑制天然免疫应答，从而为病毒复制创造有利环境。
结论：综上，本研究支持S100A4在促进甲型流感病毒感染人肺上皮细胞中发挥功能作用。S100A4并非仅作用于单一环节，而是影响病毒复制程序的多个过程，包括建立有效感染、病毒蛋白积累以及维持病毒RNA聚合酶功能。研究人员还证明S100A4能够减弱I型干扰素诱导，提示该宿主蛋白可能参与感染期间固有抗病毒防御的调节。进一步研究S100A4与IAV的分子互作，有望拓展对病毒复制机制的理解，并为宿主导向抗病毒策略的研发提供新思路，尽管靶向S100A4的安全性和选择性仍需评估。
