基于深度过滤循环与沉淀控制策略实现集成动态生物加工（IDB）纯化中深度过滤器容量10倍提升

《Biotechnology and Bioengineering》：10-Fold Improvement in Depth Filter Capacity During Integrated Dynamic Bioprocessing (IDB) Purification Through Depth Filter Cycling and Precipitate Control Strategy

　　

摘要专业翻译 在bsAb1纯化过程中，亲和捕获产物中和阶段形成了沉淀。该沉淀在集成动态生物加工（Integrated Dynamic Bioprocessing, IDB）平台上装载至第一根精纯层析柱之前被去除。该沉淀具有动态粒径分布特征，若缺乏适当表征，将导致复杂的放大问题。本研究建立了一套表征下游沉淀形成及操作深度过滤器（Emphaze AEX）的方案，将深度过滤器如同层析柱一般运行，以支持bsAb1的连续纯化。深度过滤器以“欠载”方式装载沉淀物质，随后进行追赶（chase）步骤并施加消毒缓冲液。消毒缓冲液溶解了结合在深度过滤器上的沉淀，同时控制生物负载，大幅提升了过滤器容量并有助于确保封闭系统。在实验室规模下，深度过滤器循环运行40次，总容量达到10,500 L/m2。该容量比在不进行任何循环或消毒操作、以最大容量装载时的过滤器容量高出一个数量级。由此获得的循环容量简化了深度过滤器的放大以及IDB在临床和商业规模上的实施。

论文解读

一、研究背景与问题

生物制药行业在过去三十年间经历了前所未有的增长，单克隆抗体（mAbs）和双特异性抗体（bsAbs）已成为治疗性蛋白中增长最快的细分领域。随着这些复杂生物制品从罕见病治疗向主流疗法转型，生产需求持续加剧，推动了对更高效、更具成本效益生产策略的追求。传统批次生物加工虽然成熟且符合法规要求，但在设施占地面积、资本投入和操作灵活性方面面临显著局限，难以满足全球日益增长的生物制品需求。

连续生物加工作为应对上述制造挑战的变革性方法应运而生。集成动态生物加工（IDB）代表了从传统批次操作向连续模式的范式转变，可提供减少设施占地面积、改善过程控制、提升产品质量一致性以及显著降低成本等优势。研究表明，连续下游加工相比传统批次操作可实现高达50%的生产成本（COGS）降低和70%的设施占地面积缩减。然而，向连续下游加工的过渡带来了独特的技术挑战，尤其在深度过滤操作方面。

深度过滤器在下游纯化流程中承担关键单元操作角色，提供必要的澄清和生物负载控制，同时去除宿主细胞蛋白（HCP）、宿主细胞DNA、产品聚集体和病毒等过程相关杂质。在传统批次操作中，深度过滤器以单次通过模式使用并在每批后废弃，构成显著的耗材成本和废弃物问题。对于持续10至14天的连续操作，传统单次通过方法在经济上变得不可行，因为深度过滤器的典型容量仅为每平方米过滤器面积100至300升进料，需要数十次过滤器更换并产生大量废物流。

下游加工过程中沉淀的形成是连续生物加工的另一个重大挑战。酸性捕获洗脱液的中和常因pH诱导的构象变化和静电相互作用导致蛋白质沉淀。这些沉淀通常由目标蛋白、HCP和核酸组成，可迅速堵塞深度过滤器并损害过程性能。沉淀的理化堵塞机制可由膜和深度过滤理论描述：软性蛋白质沉淀通过聚集和絮凝动态演化，其粒径分布（PSD）随pH、离子强度和剪切力变化而改变，导致过滤模式从标准/不完全孔堵塞向中间堵塞和滤饼过滤转变，降低渗透性并加速压力上升。

在bsAb1纯化过程的开发中，研究人员在IDB系统中观察到亲和捕获产品中和阶段出现高浊度，影响了过程开发进度。因此，探索替代性沉淀去除策略成为必要，即深度过滤器的多次负载循环再生。在此操作模式下，深度过滤器被当作层析柱对待：以“欠载”方式装载浊度物质，然后暴露于清洗和消毒缓冲液，溶解截留的沉淀并在14天连续操作期间控制过滤器相关管路中的生物负载。

二、研究内容与主要技术方法

本研究建立了一套表征下游沉淀形成和操作深度过滤器的完整方案。研究采用的主要关键技术方法包括：利用Pendotech正常流过滤筛选系统进行单次通过容量评估；利用AKTA Pure层析系统实施深度过滤器循环操作，通过样品泵旁路方式装载含沉淀物料，并配合1 M尿素和1 N NaOH进行系统内管路清洗；采用离心沉降法筛选可有效溶解沉淀的缓冲液体系；利用深度学习模型结合明场显微镜和Arivis图像分析平台对沉淀粒径分布进行定量表征；采用荧光显微镜对运行后深度过滤器各层进行染色分析，使用小麦胚芽凝集素（WGA）偶联AlexaFluor 488、抗人IgG1偶联AlexaFluor 647以及DAPI分别检测HCP、抗体和DNA在过滤器上的分布。此外，研究在50 L灌流生物反应器规模使用两个170 cm²的Emphaze AEX过滤器进行双联操作，验证了循环策略的可放大性。

三、研究结果

单次通过操作结果： 研究发现Emphaze AEX在加载沉淀物料至最大压力时具有1100 L/m²的单次通过容量。压力在加载阶段稳步上升，饱和后呈指数增长。以50%安全系数计算，操作规模下过滤器容量为700 L/m²，商业规模需24个1.6 m²深度过滤器，对设施适配构成负担，促使研究人员寻求延长过滤器寿命的替代策略。

沉淀粒径随时间增大： 深度学习图像分析结果显示，沉淀颗粒在混合过程中表面积分布和纤维长度均随时间增加，而总颗粒计数减少，表明沉淀颗粒随时间发生自聚集。该发现支持通过定义预期粒径分布来指导深度过滤器再生的放大实施，并提示可通过控制沉淀混合时间来调节颗粒大小，从而影响过滤器性能。

沉淀再溶解特性表征： 离心研究表明，沉淀暴露于氢氧化钠时迅速形成黄色水凝胶且无法再溶解，因此应避免直接接触NaOH。强酸可使沉淀产生“水母效应”——沉淀边缘逐渐变透明直至仅剩半透明网状结构。在供应商建议的pH 5-9范围内，1 M尿素50 mM Tris pH 7.4缓冲液可有效溶解沉淀并呈现类似水母效应，且尿素预处理可防止后续NaOH暴露时的蛋白质水凝胶形成。明场显微镜时间过程实验证实了尿素对沉淀的变性溶解作用。

循环操作实现10倍容量提升： Emphaze AEX过滤器成功循环40次后才达到最大操作压力。操作保持了各循环间一致的85%收率，同时实现持续的1个对数级HCP去除和3个对数级DNA去除。以50%安全系数计算，循环过程的操作规模最大容量为7000 L/m²，较单次通过容量提升一个数量级。压力分布显示0至9000 L/m²间压力增量平缓，9000至10400 L/m²间呈指数增长，7000至9000 L/m²间的稳定压力上升为操作提供了稳健的安全裕度。三缓冲液清洗系统（CIP）中，1 M尿素阶段主要溶解蛋白质，1 N NaOH和0.5 M NaCl再平衡阶段实现DNA溶解，依据260/280 mAU比值约1.8判断。

过滤器染色分析： 荧光染色结果显示过滤器上存在宿主细胞蛋白和双特异性抗体信号，而DNA信号极少。这表明过滤器失效（压力随运行时间增加）的主要原因是HCP和bsAb在过滤器各层上的持续累积。

50 L IDB规模验证可放大性： 在17天连续纯化运行中，两个170 cm²过滤器各实现4000 L/m²通量，收率88%，与实验室规模3.8 cm²过滤器相当。运行期间压降小于5 psi，远低于35 psi的最大允许压力，表明该循环策略可成功放大应用于bsAb1的连续纯化。

临床和商业规模过滤器需求减少： 循环操作使GMP规模所需深度过滤器数量减少10倍。在临床规模（500 L）下，循环操作允许使用1020 cm²过滤器，无需不锈钢支架，缓解了设施适配问题，同时循环操作可在IDB运行期间实现生物负载控制。

四、讨论与结论

通过沉淀表征和新型循环操作，Emphaze AEX过滤器容量实现了十倍提升。以50%放大安全系数计算，单次通过操作容量为700 L/m²，循环操作容量为7000 L/m²。循环容量大幅降低了临床和商业规模下的过滤器需求，简化了连续生物加工在各设施中的实施。深度过滤由此成为IDB工具箱中可行的单元操作，拓展了连续加工在生物制药行业的适用性。

本研究同时强调了在下游生物加工中研究沉淀形成以确定理想溶解缓冲液的重要性。沉淀表征研究揭示该沉淀为宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和目标bsAb的混合物，需依次暴露于离液剂尿素和氢氧化钠才能完全溶解，以相反顺序暴露将导致蛋白质水凝胶形成。观察沉淀粒径分布的动态特性有助于指导深度过滤在连续系统中的实施，结果表明延长沉淀混合时间可通过限制小颗粒数量来提升过滤器性能。后续研究将继续探索其他生物制品中和过程中下游沉淀形成的机制，以确定沉淀机制是否具有普遍性，从而改进缓解策略并简化多个项目的放大实施。