液晶纳米粒介导庆大霉素与重组人脱氧核糖核酸酶I共递送对抗成熟大肠杆菌ATCC 25922生物膜

《International Journal of Pharmaceutics》：Liquid crystalline nanoparticle-mediated co-delivery of gentamicin and rhDNase against mature Escherichia coli ATCC 25922 biofilms

细菌生物膜是嵌入自身分泌的细胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质中的高度结构化微生物群落，该基质由多糖、蛋白质、脂质和细胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）组成。生物膜相关感染构成重大临床挑战，因为EPS基质作为物理和生化屏障，限制抗菌药物渗透、促进细菌持续存在，并保护细菌免受宿主免疫应答的影响（Flemming等，2016）。生物膜介导的感染在慢性伤口、烧伤、植入式医疗器械和导尿管中尤为棘手，其导致持续炎症、组织愈合延迟、反复感染和抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）增加（Bjarnsholt, 2013）。重要的是，生物膜内细菌可表现出比浮游菌高10–1000倍的抗生素耐受水平，使得常规抗生素难以将其根除（Ciofu等，2017）。庆大霉素（gentamicin, GEN）是一种广泛用于治疗革兰阴性菌感染的氨基糖苷类抗生素，对浮游菌表现出强效活性，但由于其通过带负电的EPS基质渗透能力差，且难以到达代谢休眠的细菌群体，因此对成熟生物膜疗效有限（Stewart, 2002）。氨基糖苷类的带正电荷氨基容易与带负电的生物膜组分（尤其是eDNA）相互作用，导致抗生素在生物膜外周被截留，向深层细菌层运输减少（Rath等，2025；Okshevsky和Meyer, 2015）。因此，能够同时破坏生物膜结构并提高抗生素在感染微环境中渗透和滞留的联合疗法日益受到关注（Choi等，2023）。细胞外DNA现被公认为细菌生物膜的关键结构组分，有助于生物膜黏附、机械稳定性、黏附性和抗生素耐受性（Panlilio和Rice, 2021）。重组人脱氧核糖核酸酶I（recombinant human deoxyribonuclease I, rhDNase），临床上以阿法脱氧核糖核酸酶（dornase alfa）用于囊性纤维化，可酶促降解eDNA，已成为一种有前景的生物膜分散佐剂（Ahsan等，2024）（图1）。前期研究表明，DNase介导的eDNA降解可使生物膜结构失稳、提高抗生素渗透性并增强细菌对抗菌药物的敏感性（Wongkaewkhiaw等，2020；Lopes等，2015）。然而，酶促抗生物膜疗法的临床转化仍受快速酶降解、生物环境中不稳定以及感染部位滞留差等因素的限制。蛋白水解性降解对慢性伤口和富含细菌及宿主来源蛋白酶的感染环境中的蛋白质治疗药物而言尤为重要（Thorn等，2021）。GEN与rhDNase的三维分子结构如图1所示。基于脂质的纳米载体作为能够提高抗菌药物稳定性、渗透性和治疗效果的递送系统受到广泛关注。其中，液晶纳米粒（liquid crystalline nanoparticles, LCNPs）具有由高度弯曲的脂质双层和含水纳米通道分隔的非层状内部纳米结构（Ahsan等，2024；Barriga等，2019）。这些纳米结构提供了极大的界面面积，能够包封亲水性、疏水性和两亲性分子，同时实现控制释放并增强与生物膜的作用。基于单油酸甘油酯的LCNPs（MO-LCNPs）尤其表现出优异的生物相容性、生物黏附性以及通过生物屏障（包括细菌生物膜）改善抗菌药物递送的能力，这一点已在研究人员先前的工作中得到证实（Ahsan等，2024；Ahsan等，2026）。其柔软、可形变的非层状结构及近中性表面电荷还与增强生物膜内抗菌活性分布和改善抗生素在细菌群落中的分布相关（Thorn等，2021）。此前，研究人员证明负载GEN的LCNPs相比传统脂质体系统和无制剂抗生素溶液，显著增强了GEN对大肠杆菌（Escherichia coli）生物膜的抗生物膜活性（Ahsan等，2025）。然而，尽管LCNP介导的抗生素递送显示出前景，LCNP系统内抗生素与生物膜破坏酶的共递送仍鲜有探索。特别是，LCNPs同时稳定酶治疗药物、保护其免遭蛋白水解降解并协同增强抗生素对成熟生物膜活性的能力尚未得到全面研究。因此，本研究旨在开发并表征共同负载GEN和rhDNase的基于MO的LCNPs，作为一种针对大肠杆菌生物膜的多模式抗生物膜纳米治疗策略。选择大肠杆菌ATCC 25922作为充分表征的参考菌株，其提供标准化、可复制的革兰阴性生物膜模型，并可与研究人员先前对GEN负载LCNPs与脂质体并排评估的结果进行直接比较（Ahsan等，2025）；在此处用作参考模型而非临床分离株。研究人员系统比较了LCNP制剂的理化性质、形态、稳定性、载药量、释放行为、蛋白水解保护、细胞相容性和抗生物膜功效，并与常规DPPC:DPPG脂质体及无制剂对照进行比较。研究人员假设，LCNPs的非层状液晶纳米结构可改善生物膜内抗菌活性的分布、维持治疗药物释放、保护rhDNase免遭蛋白水解降解，并通过同时破坏基质和增强抗生素递送来增强GEN的抗生物膜活性。

液晶纳米粒介导庆大霉素与重组人脱氧核糖核酸酶I共递送对抗成熟大肠杆菌ATCC 25922生物膜：一种多模式抗菌纳米策略的构建与评价

细菌生物膜相关感染是临床治疗中的重大难题。生物膜内的细菌被包裹在由多糖、蛋白质、脂质和细胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）等组成的细胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质中，该基质作为物理和生化屏障限制抗生素渗透，并赋予生物膜内细菌较浮游菌高10–1000倍的抗生素耐受水平。庆大霉素（gentamicin, GEN）虽对浮游革兰阴性菌具有强效杀菌活性，但因其正电荷氨基与生物膜中带负电的eDNA等组分发生静电相互作用而被截留于生物膜外周，难以有效渗透至深层菌群，故对成熟生物膜疗效有限。重组人脱氧核糖核酸酶I（recombinant human deoxyribonuclease I, rhDNase）可酶促降解eDNA、破坏生物膜结构，但其在蛋白酶丰富的感染环境中易被降解、滞留性差。因此，构建可同时递送抗生素与生物膜分散酶、并保护酶活性的纳米递送系统，成为提高抗生物膜疗效的重要策略。本研究旨在开发基于单油酸甘油酯的液晶纳米粒（liquid crystalline nanoparticles, LCNPs）共同负载GEN与rhDNase，以成熟大肠杆菌ATCC 25922生物膜为模型，系统评价其理化性质、释放行为、蛋白水解保护作用及抗生物膜功效，并与常规DPPC:DPPG脂质体进行比较。

研究人员采用水溶性稀释法制备了负载GEN、rhDNase及二者共载的MO-LCNPs，并以微流控法制备对应脂质体。通过动态光散射、纳米颗粒跟踪分析、冷冻透射电镜、超滤法、SDS-PAGE、MBEC?生物膜测定、结晶紫染色、激光共聚焦显微镜和MTT法，对制剂粒径、Zeta电位、形貌、稳定性、包封率、释放曲线、rhDNase抗蛋白酶降解能力、抗生物膜活性、导管表面抑菌/清除效果及细胞相容性进行了系统表征，并使用Bliss独立性模型分析GEN与rhDNase的协同作用。

结果表明，LCNPs在单载和共载条件下均保持约150–170 nm的粒径，多分散系数（PDI）约0.15–0.30，显著低于脂质体（PDI约0.50–0.65）。LCNPs对GEN的包封率高达95%以上，且共载不影响各药物的负载；体外释放实验中，LCNPs对GEN具有缓释作用，对rhDNase则表现出显著滞留（240 min释放约20–30%），而游离rhDNase快速通过膜。更重要的是，经蛋白酶K处理后，LCNP负载的rhDNase仍保留接近天然的蛋白条带强度和大部分生物膜分散活性，而游离rhDNase几乎完全降解，脂质体仅提供部分保护。在GEN:rhDNase比例优化中，1:0.4（质量比）的共载LCNPs对成熟生物膜产生最大杀伤（约3–4 log10 CFU/mL降低），继续增加酶比例无额外收益。Bliss分析显示，GEN与rhDNase在特定浓度组合下产生正协同效应，且LCNP介导的共递送产生更广泛的正ΔBliss区域。在MBEC?试验中，GEN+rhDNase-LCNPs使可回收活菌数降低约5–6 log10 CFU/mL，显著优于游离药物、单一载药LCNPs及脂质体制剂。共聚焦图像显示，GEN+rhDNase-LCNPs处理导致视野内碘化丙啶（PI）阳性（膜受损）细菌分布最广，且生物膜结构明显疏松。在导尿管表面模型中，共载LCNPs对生物膜形成的抑制率约90–95%，并使预形成生物膜生物量降至对照的25–30%。细胞毒性实验表明，在有效抗生物膜浓度（GEN≤5 μg/mL）下，共载LCNPs维持HaCaT角质形成细胞活力>90%。

研究结论指出，LCNP介导的GEN与rhDNase共递送通过整合抗生素递送、酶促基质破坏和酶保护，显著增强了对成熟大肠杆菌ATCC 25922生物膜的抗生物膜活性，优于无制剂处理和常规脂质体对照。该策略为生物膜相关感染的纳米治疗提供了有力的概念验证基础，但其普适性仍需在更多菌株、多菌种及体内模型中进一步验证。