## 中文标题 灵菌红素通过调控HIF-1α/YAP相关信号通路保护骨髓间充质干细胞免于缺氧诱导的凋亡

《Frontiers in Systems Biology》：Prodigiosin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells from hypoxia-induced apoptosis by modulating HIF-1α/YAP-associated signaling

引言：骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）在再生医学中应用广泛，但其在缺氧微环境中存活率低下限制了治疗效果。本研究探讨灵菌红素（Prodigiosin）是否保护BMSCs对抗氯化钴（CoCl₂）诱导的缺氧损伤，并探究缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF-1α）/Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）相关信号的参与。方法：培养BMSCs并以流式细胞术进行表型鉴定。以CoCl₂（100 μM，24 h）诱导缺氧。细胞接受灵菌红素（20 nM）和/或维替泊芬（Verteporfin，0.5 μM）处理，或转染HIF-1α siRNA。以CCK-8检测活力；以Annexin V/PI和DAPI检测凋亡；以DHE检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）；以Western blot检测蛋白表达。数据采用方差分析（ANOVA）或非配对t检验分析（P < 0.05）。结果与讨论：CoCl₂暴露降低BMSCs活力、增加凋亡、促进ROS蓄积并诱导HIF-1α表达。上述变化伴随p-YAP/YAP比值下降及Bax和活化型caspase-3表达升高。灵菌红素处理减轻CoCl₂诱导的细胞毒性，抑制ROS蓄积与凋亡，并部分恢复p-YAP/YAP比值。此外，YAP抑制剂维替泊芬和HIF-1α敲低均减少缺氧诱导的凋亡，支持HIF-1α/YAP相关信号参与缺氧应激下BMSC损伤。综上，结果提示灵菌红素保护BMSCs免于缺氧诱导的凋亡，至少部分通过调控HIF-1α/YAP相关信号实现，可能有助于改善缺氧再生环境中干细胞的存活。

## 论文主体内容解读

**研究背景与问题** 骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）因自我更新、多向分化潜能及免疫调节特性而成为再生医学的候选细胞，但移植细胞在缺血或损伤组织中氧供严重不足，存活率低下，成为制约疗效的瓶颈。缺氧诱导的凋亡是移植BMSCs丢失的主要原因，持续缺氧促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）蓄积、线粒体功能障碍并激活促凋亡通路，然而将缺氧应激与BMSCs凋亡联系起来的信号事件尚未阐明。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF-1α）是氧剥夺反应的核心介质，但其功能输出高度依赖情境：轻中度生理性缺氧（1%–7% O₂）下短暂激活HIF-1α可促进存活、迁移与血管生成能力，缺氧预处理亦被广泛用于改善移植后存活；而在严重或持续缺氧下，HIF-1α过度蓄积可超出适应能力，促发氧化损伤与凋亡。Hippo通路主要下游效应分子Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）同样调控应激相关细胞命运。已有研究提示HIF-1α与YAP在缺氧下可能存在功能性相互作用，但方向取决于细胞情境与应激强度；Wang等报道HIF-1α/YAP激活可保护大鼠BMSCs对抗椎间盘退变微环境中压缩诱导的凋亡，而该通路是否参与更严重缺氧应激下BMSCs的凋亡尚不清楚。灵菌红素（Prodigiosin）是粘质沙雷菌等产生的天然三吡咯色素，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化与细胞保护活性；鉴于ROS蓄积在缺氧诱导凋亡中的重要作用，其可能保护BMSCs免于缺氧损伤，但能否在病理性缺氧下维持BMSC存活及其是否涉及HIF-1α/YAP相关信号仍不明确。为此，研究人员采用CoCl₂化学缺氧模型，检验灵菌红素对BMSCs缺氧性凋亡的保护作用及HIF-1α/YAP相关信号的参与。

**主要技术方法** 研究使用购自Cyagen Biosciences（苏州）有限公司的小鼠BMSCs（货号MUBMX-01001），取第2代细胞用于全部实验。关键技术包括：以流式细胞术进行CD90/CD45表型鉴定；以CoCl₂梯度浓度与时间建立化学缺氧模型；以CCK-8法检测细胞活力；以Annexin V–FITC/碘化丙啶（propidium iodide, PI）流式细胞术及DAPI核染色检测凋亡；以二氢乙锭（dihydroethidium, DHE）探针检测细胞内ROS；以Western blot检测HIF-1α、GLUT1、活化型caspase-3、Bax、YAP及p-YAP Ser127蛋白表达；以siRNA转染敲低HIF-1α；并以YAP抑制剂维替泊芬（Verteporfin）进行药理学干预。

**研究结果**

*CoCl₂建立类缺氧应激模型并激活BMSCs中HIF-1α信号*：细胞呈典型纺锤形，95.53%为CD90⁺/CD45^-，符合BMSC表型。CCK-8显示24 h时1–100 μM CoCl₂对活力影响不大，200 μM显著降低活力；48 h时高浓度下活力下降更明显。HIF-1α蛋白随CoCl₂浓度升高而增加，100与200 μM时显著高于对照；200 μM虽诱导最强但细胞毒性大，故选择100 μM、24 h。GLUT1蛋白亦随浓度升高并与HIF-1α正相关，提示激活的是类缺氧转录程序而非单纯蛋白稳定。结论：100 μM CoCl₂处理24 h可在不明显损失活力的前提下建立类缺氧应激模型。

*灵菌红素减轻BMSCs缺氧诱导的细胞毒性*：CoCl₂在24 h和48 h均显著降低BMSC活力。24 h时20 nM灵菌红素显著恢复活力，10 nM作用有限，更高浓度无进一步增强；48 h时10 nM显著改善活力，而20 nM及以上失去保护并伴活力下降。结论：灵菌红素在窄浓度窗口内发挥保护作用，最佳浓度取决于暴露时长。

*灵菌红素减轻BMSCs缺氧诱导的凋亡性损伤*：研究指出CCK-8反映整体代谢活性，而Annexin V/PI为凋亡特异检测的金标准正交方法。CoCl₂显著增加总凋亡率，20 nM灵菌红素明显降低之；DAPI染色显示CoCl₂引起明显核浓缩与碎裂，灵菌红素可减轻该形态学改变；DHE检测显示CoCl₂显著增加ROS产生，而灵菌红素共处理使荧光强度降至接近对照水平。结论：灵菌红素减轻缺氧诱导的氧化应激与凋亡。

*灵菌红素抑制缺氧BMSCs中HIF-1α信号与凋亡相关蛋白表达*：RT-qPCR显示CoCl₂显著升高HIF-1α与活化型caspase-3 mRNA，灵菌红素共处理显著降低二者；Western blot显示CoCl₂升高HIF-1α、活化型caspase-3与Bax蛋白水平，灵菌红素显著减弱上述升高。结论：灵菌红素下调缺氧与凋亡相关分子标志物，与细胞水平抗凋亡效应一致。

*灵菌红素通过调控HIF-1α/YAP相关信号减轻BMSCs缺氧诱导的凋亡*：CoCl₂显著升高HIF-1α、YAP1、p-YAP1、活化型caspase-3与Bax表达；灵菌红素共处理显著降低YAP1、p-YAP1、活化型caspase-3与Bax，而HIF-1α未见显著下降；维替泊芬同样降低YAP1、p-YAP1、活化型caspase-3与Bax，且不显著降低HIF-1α。流式显示CoCl₂显著增加凋亡细胞比例，灵菌红素明显减少，维替泊芬亦部分减轻凋亡增加。结论：灵菌红素与维替泊芬均减轻CoCl₂诱导的凋亡反应并伴YAP1与p-YAP1表达下降，但仅凭此尚不能确立HIF-1α/YAP因果轴。

*HIF-1α介导缺氧条件下灵菌红素的抗凋亡效应*：以siRNA敲低HIF-1α与灵菌红素处理平行进行。分子水平上，两种干预均抑制HIF-1α蛋白并伴随YAP磷酸化改变（总YAP降低、p-YAP Ser127恢复），活化型caspase-3与Bax同步下降提示凋亡信号减弱；表型上，Annexin V/PI流式证实二者均显著且程度相当地减少CoCl₂诱导的凋亡。结论：药理学与遗传学两种独立HIF-1α抑制方式的分子与表型结果汇聚，支持灵菌红素至少部分通过调控HIF-1α/YAP相关信号发挥抗凋亡作用。研究总结指出，CoCl₂模拟缺氧下HIF-1α蓄积伴YAP相关信号失调及下游转录活性增强，伴Bax与活化型caspase-3上调，最终促进BMSC凋亡；灵菌红素通过抑制HIF-1α蓄积、伴YAP相关信号正常化并降低凋亡标志物表达而减轻该过程；siRNA敲低HIF-1α可表型模拟灵菌红素的抗凋亡作用，进一步支持其HIF-1α依赖性。

**讨论与结论** 讨论指出，严重CoCl₂缺氧（100 μM，24 h）下HIF-1α蓄积伴ROS与凋亡升高，与轻度缺氧下的保护作用形成情境依赖的转换，与既往关于缺氧严重程度决定p53介导结局的报道一致；HIF-1α诱导先于凋亡、HIF-1α敲低可模拟灵菌红素效应、维替泊芬不依赖CoCl₂浓度减轻凋亡等观察支持HIF-1α介导成分，并提示此严重缺氧条件下HIF-1α促损伤而非保护。研究关键发现是YAP参与缺氧应激下BMSC凋亡反应并可能与HIF-1α信号功能关联；模型中p-YAP/YAP比值降低与YAP靶基因表达升高提示YAP活性增强，与Bax及活化型caspase-3升高同时出现，维替泊芬抑制YAP可减少凋亡标志物并减轻细胞死亡，支持此情境下YAP的促凋亡作用。作者将结果与Wang等（2020）HIF-1α/YAP保护性报道相调和：后者采用机械压缩合并中度缺氧的较轻应激，而本模型为严重化学缺氧伴直接氧化损伤，且24 h持续暴露不同于预处理研究的短暂间歇缺氧（1–4 h），持续缺氧可致线粒体功能障碍与caspase-3激活；两类模型并存的应激源（机械 vs 氧化）不同，可能招募不同下游效应分子，故HIF-1α或如"应激变阻器"般取决于刺激性质、强度与持续时间，本研究结果是对Wang等的补充而非矛盾。HIF-1α敲低不仅减轻凋亡损伤还减弱YAP相关信号变化，提示二者功能关联且HIF-1α可能位于YAP上游，但直接调控仍需验证；由于未进行HIF-1α过表达或组成性活化YAP的挽救实验，该通路应视为有强支持的机制关联而非完全确立的线性级联。讨论还强调灵菌红素生物活性的情境依赖性：既往多关注其抗菌抗肿瘤作用，本研究提示其在类缺氧应激下对正常干细胞具细胞保护作用；保护作用见于较窄浓度范围，提示作为预处理剂前需仔细优化剂量。最佳保护浓度由24 h的20 nM转为48 h的10 nM，此双相反应可能反映不同时间尺度上两种竞争活性：低浓度（10–20 nM）下作为快速ROS清除剂减轻氧化应激，而延长暴露与更高浓度逐渐启动其抗增殖与促凋亡活性并最终压倒保护效应，界定出10–20 nM、≤24 h的治疗窗，符合许多细胞保护剂的毒物兴奋剂量反应；该保护机制与其抗癌机制不同（后者经ROS生成与caspase激活诱导凋亡）。局限性包括：CoCl₂模型不能完全复现物理低氧复杂性并可能带入钴特异效应，100 μM与50 μM在24 h的活力差异无统计学意义（96.5% ± 4.2% vs 98.1% ± 3.7%，P = 0.645）但无差异不等于等效且样本量小（n = 3），100 μM的选择基于其诱导HIF-1α而不明显致毒及既往研究使用，并非正式等效性检验，未来应以可控低氧培养系统或非金属缺氧模拟物验证；灵菌红素直接分子靶点未知；YAP上调Bax与活化型caspase-3的下游转录机制及HIF-1α是否直接调控YAP需通过YAP核定位分析、TEAD依赖转录实验、免疫共沉淀或挽救实验阐明；所有实验均为体外，尚需体内研究确定灵菌红素能否改善缺血组织中移植BMSCs的存活与疗效。

结论翻译：总之，本研究提供证据表明灵菌红素保护BMSCs免于缺氧诱导的凋亡，至少部分通过调控HIF-1α/YAP相关信号实现。这些发现提示灵菌红素作为潜在细胞保护剂值得进一步研究，但仍需体内研究确定其在改善缺血组织干细胞存活方面的转化潜力。