## 中文标题 绿色合成植物介导的ZnO纳米颗粒作为潜在纳米植物治疗剂：靶向活性氧（ROS）驱动的HepG2肝癌细胞抗癌活性

《Frontiers in Oncology》：Green synthesized plant mediated zinc oxide nanoparticles as potential nano phytotherapeutic agents for reactive oxygen species driven anticancer activity in HepG2 liver cancer cells

绿色纳米技术已成为可持续合成金属氧化物纳米颗粒的一种有前景的方法，在癌症治疗中具有潜在应用。本研究采用大花牛膝菊（*Galinsoga parviflora*，GP）、胜红蓟（*Ageratum conyzoides*，AC）和蓟罂粟（*Argemone mexicana*，AM）的水提物作为绿色介导剂，生物合成氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）。表征结果证实，所合成的ZnO-NPs为相纯度高的结晶体，具有六方纤锌矿结构，形貌以球形为主。平均粒径分别为12.33 ± 5.58 nm（GP-ZnO）、12.05 ± 4.51 nm（AM-ZnO）和10.32 ± 1.98 nm（AC-ZnO），整体粒径范围为5–36 nm。Zeta电位在?8.2至?8.6 mV之间，表明其静电稳定性较弱，并具有聚集倾向，这与场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）图像中所观察到的结果一致。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了ZnO的形成，并显示其表面残留有植物来源的成分；X射线衍射（XRD）显示出对应于纤锌矿ZnO的（100）、（002）、（101）、（102）、（103）、（110）和（112）晶面的特征衍射峰。生物合成的ZnO-NPs表现出良好的生物相容性，对正常THLE-2肝细胞显示出极低的溶血性和可忽略的细胞毒性。GP-ZnO、AM-ZnO和AC-ZnO-NPs对HepG2癌细胞表现出浓度依赖性细胞毒性，半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为60.25 ± 3.2、68.35 ± 3.4和74.15 ± 2.6 μg/mL。处理显著增强了细胞内活性氧（ROS）水平和Annexin V⁺细胞比例，其中GP-ZnO和AM-ZnO-NPs分别诱导59.71%和57.40%的Annexin V⁺细胞，而阿霉素（Dox）为50.05%。尽管其ROS水平低于Dox，但更高的凋亡细胞比例提示，不依赖ROS的机制可能也参与了细胞毒性作用。然而，由于未进行碘化丙啶（PI）染色，无法区分晚期凋亡与坏死。总体而言，植物介导的ZnO-NPs作为可持续的候选材料，值得进一步开展体内研究和转化开发，用于肝癌纳米治疗。

## 论文主体内容解读

**研究背景与问题** 癌症仍是全球人类发病和死亡的主要原因之一，其中肝癌属于侵袭性最强、应答最差的类型之一。传统治疗面临全身毒性、多药耐药、肿瘤选择性差及高复发率等挑战，亟需有效、安全且可持续的疗法。纳米医学中，金属氧化物纳米颗粒因独特理化性质、表面反应性和生物相容性而备受关注，其中ZnO-NPs对恶性细胞具有选择性细胞毒性，且生物安全性好、成本低、易于制备。传统化学合成方法（溶胶-凝胶、水热法、化学气相沉积、化学沉淀等）虽可精确控制晶体结构与粒径，但常涉及危险化学品、有毒溶剂、高能耗或生态有害副产物，促使研究人员转向绿色合成。植物介导合成因简便、可放大、低成本且无需复杂微生物培养而具优势，植物提取物中的生物碱、黄酮、酚类、萜类、氨基酸、多糖和维生素等次生代谢物可还原金属离子并稳定纳米结构。大花牛膝菊（GP）、胜红蓟（AC）和蓟罂粟（AM）同属菊科，是广泛分布于印度及热带、亚热带地区的常见杂草，富含具抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌活性的生物活性成分，但在绿色纳米医学应用中研究不足。此前GP曾被用于氧化铁纳米颗粒生物合成；AM曾被用于氧化铁、银、金、NiO和ZnO纳米颗粒的绿色合成，其抗癌活性仅见金纳米颗粒对结肠癌细胞的报道；AC的ZnO-NPs研究多限于抗菌应用。据研究人员广泛分析，这是首个比较GP、AC和AM三种杂草类植物生物合成ZnO-NPs抗肝细胞癌（HCC）疗效并探究其ROS介导凋亡机制的研究。HCC在体外常用HepG2细胞建模，绿色合成、可产ROS的ZnO-NPs为靶向该癌症的可持续纳米医学提供了有前景的途径。

**关键技术方法** 研究以六水合硝酸锌[Zn(NO₃)₂·6H₂O]为锌前体，用三种植物叶水提物在碱性条件（pH 12.0 ± 0.1、70 °C、搅拌1 h）下介导合成，并于400 °C煅烧2 h获得结晶ZnO-NPs；采用TEM、FE-SEM、EDS、Zeta电位、FT-IR和粉末XRD进行表征；以ASTM F756-17原则开展红细胞溶血试验评估血液相容性；用MTT法在HepG2和正常THLE-2肝细胞系上评价细胞毒性与IC₅₀；用DCFH-DA荧光法（定性）和ROS检测试剂盒（定量）测定细胞内ROS；用Annexin V-FITC流式细胞术检测凋亡；统计分析采用GraphPad Prism 10.0的非线性回归、单因素方差分析（ANOVA）及Tukey HSD事后检验。植物材料采自印度Hathras、北方邦及Galgotias大学大诺伊达校区，凭证标本保存于该校标本馆（编号GU/2025/021）。

**研究结果**

3.1 植物介导的ZnO-NPs绿色合成：三种水提物通过植物化学介导的沉淀法成功制备AM-ZnO、AC-ZnO和GP-ZnO，反应中出现浅黄色或类白色沉淀并经煅烧得到细结晶粉末；酚类、黄酮、萜类、生物碱、甾醇、β-胡萝卜素、α-生育酚和脂肪酸被提出发挥双重作用——作为天然还原剂将Zn²⁺转化为中间体Zn(OH)₂再经煅烧转为结晶ZnO，同时作为稳定和封端剂抑制颗粒失控生长与聚集；锌全程保持+2价，无Zn²⁺的电子转移还原，区别于贵金属纳米颗粒合成。

3.2 FT-IR分析：三种提取物光谱显示3200–3500 cm^?1宽羟基吸收带及指纹区差异，证实均富含抗氧化植物化学物；ZnO-NPs在3477–3496 cm^?1显示O-H伸缩振动、1638–1646 cm^?1为H-O-H弯曲振动、1320–1342 cm^?1可归因于残留表面吸附硝酸根（NO₃^?）的不对称伸缩，450–600 cm^?1尖锐Zn-O伸缩带证实ZnO成功形成。

3.3 EDS分析：三种配方均显示清晰的Zn和O峰及残留碳信号，Zn:O原子比分别为GP-ZnO 46.35:20.02、AM-ZnO 58.01:32.41、AC-ZnO 45.78:24.40；偏离理想1:1化学计量归因于EDX对轻元素定量的固有局限（氧系统性低估、C与O谱峰重叠等），但Zn、O为主峰且无意外金属杂质峰，说明前体有效转化为ZnO。

3.4 粉末XRD分析：三种配方均显示可索引为六方纤锌矿ZnO（JCPDS卡号36-1451）的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）和（201）晶面衍射峰，无杂相或未反应前体峰；由最强峰（101）经Debye-Scherrer方程计算的平均微晶尺寸为GP-ZnO 18.55 nm、AC-ZnO 19.43 nm、AM-ZnO 11.20 nm。

3.5 形貌、粒径与Zeta电位：HR-TEM与FE-SEM显示三种纳米制剂以球形至准球形为主并伴不同程度聚集；GP-ZnO平均粒径12.33 ± 5.58 nm（n = 100，右偏分布，含至36.04 nm的少数大颗粒），AC-ZnO为10.32 ± 1.98 nm（n = 100，分布较窄对称），AM-ZnO为12.05 ± 4.51 nm（n = 96，右偏分布）；AM-ZnO的XRD与TEM粒径比约1.08，提示以单晶颗粒为主。Zeta电位主峰均为负值（GP-ZnO：?8.2 ± 0.3 mV；AC-ZnO与AM-ZnO：?8.6 ± 0.3 mV），提示静电稳定有限、存在聚集倾向。

3.6 ZnO-NPs毒性评价：所有植物提取物对健康红细胞无毒；ZnO-NPs在25 μg/mL以下血液相容性优良，50和100 μg/mL时呈浓度依赖性红细胞膜损伤，100 μg/mL时GP-ZnO、AM-ZnO和AC-ZnO溶血率分别为11.16 ± 4.29%、12.03 ± 5.58%和15.78 ± 4.87%，而Dox为66.28 ± 4.08%；对正常THLE-2肝细胞，100 μg/mL时细胞活力分别为80.83 ± 7.58%、81.36 ± 6.68%和75.21 ± 2.79%，而Dox仅35.75 ± 6.92%。ANOVA与Tukey HSD显示各提取物与各ZnO配方间无统计学显著差异，但均与Dox存在极显著差异（p < 0.0001）。

3.7 ZnO-NPs抗癌活性：MTT法显示ZnO-NPs以剂量依赖方式降低HepG2细胞代谢活性与活力，10 μg/mL时活力仍达86–92%，50 μg/mL时GP-ZnO、AM-ZnO和AC-ZnO分别为60.78 ± 3.21%、58.95 ± 4.09%和55.95 ± 3.82%，150 μg/mL时降至23.05 ± 2.17%、24.56 ± 2.25%和26.79 ± 4.15%；IC₅₀分别为60.25 ± 3.2、68.35 ± 3.4和74.15 ± 2.6 μg/mL，Dox为10.23 ± 1.35 μg/mL。各ZnO配方间细胞毒性差异无统计学意义（p = 1.00），提示植物提取物种类未引入显著不同的生物学表现；但缺乏仅植物提取物及等摩尔Zn²⁺对照限制了机制解释。

3.8 活性氧研究：DCFH-DA荧光共聚焦显示所有ZnO-NPs处理组荧光增强并伴细胞皱缩、膜解体等凋亡形态改变；定量分析中Dox荧光强度最高，50 μg/mL时GP-ZnO、AM-ZnO和AC-ZnO的RFU分别为223.0、207.6和102.7，75 μg/mL时GP-ZnO最高（258.86 RFU）、AM-ZnO次之（252.81 RFU）、AC-ZnO最低（122.25 RFU），100 μg/mL时分别升至285.63、268.27和194.60 RFU；Tukey检验显示GP-ZnO（p = 0.0399）和Dox（p = 0.0015）产生的ROS显著高于AC-ZnO，而GP-ZnO与AM-ZnO、GP-ZnO与Dox、AM-ZnO与Dox间无显著差异。

3.9 Annexin V凋亡检测：流式结果显示未处理细胞Annexin V⁺比例仅1.20%，各ZnO-NPs处理组显著升高，GP-ZnO（59.71%）和AM-ZnO（57.40%）最高，甚至高于Dox（50.05%），AC-ZnO为36.91%；结合细胞毒性与ROS数据，支持凋亡过程参与ZnO-NP诱导的HepG2细胞死亡，但ROS产生并非细胞毒性的唯一决定因素；因未加PI或7-AAD活性鉴别染料，无法区分晚期凋亡与坏死。

**讨论与结论** 讨论指出，本研究抗癌效果与其他研究者关于ZnO-NPs在多种癌症中治疗潜力的报道一致（如T24膀胱癌细胞、*Acantholimon serotinum*介导ZnO-NPs、*Swertia chirayita*介导ZnO-NPs对HCT-116和Caco-2的抑制作用）；ZnO可生物降解为生理调控的Zn²⁺，块体ZnO被FDA认定为一般公认安全（GRAS），多项体外与血液学研究支持其良好生物相容性，而Dox呈浓度依赖性溶血。研究中的一个有趣发现是ROS与Annexin V反应不一致：三种ZnO-NPs的ROS水平均低于Dox，但GP-ZnO和AC-ZnO诱导的Annexin V⁺细胞更高，AC-ZnO的ROS较低而凋亡比例居第二高，提示ROS并非ZnO-NPs介导凋亡的唯一驱动因素；ZnO-NPs内化后释放Zn²⁺，可破坏线粒体功能、激活caspase依赖性凋亡通路并诱导内质网应激和钙失衡，从而通过ROS依赖与不依赖机制促进凋亡，且DCFH-DA可能无法完全捕获局部线粒体ROS。

结论翻译：本研究报道了利用大花牛膝菊（*G. parviflora*）、胜红蓟（*A. conyzoides*）和蓟罂粟（*A. mexicana*）水提物绿色合成ZnO-NPs。这些被忽视的植物在本研究中被提出作为纳米医学的可持续资源。提取物中的植物化学物作为天然还原剂和稳定剂，形成了相纯、结晶、近球形、纳米级、具六方纤锌矿结构的ZnO-NPs。在所测试的ZnO-NPs中，GP-ZnO显示出最高的数值细胞毒性，尽管各纳米颗粒间差异无统计学意义。此外，ROS和Annexin V⁺细胞的增加提示氧化应激和凋亡过程参与其中。值得注意的是，凋亡反应与ROS产生并不一致平行，提示ROS产生本身可能不能完全解释所观察到的细胞毒性作用。此外，未联合PI或7-AAD的Annexin V染色无法区分晚期凋亡和/或坏死性细胞死亡的贡献，需进一步的机制验证。再者，缺乏植物提取物对照和等摩尔Zn²⁺对照，难以区分残留植物成分与释放的Zn²⁺对观察效应的各自贡献。未来研究应纳入这些对照，并结合体内、药代动力学和安全性评估，以阐明潜在机制并评价植物介导ZnO-NPs作为环境友好型抗癌纳米治疗剂的转化潜力。