枯草芽孢杆菌CECT30572作为生物肥料稳定剂：合成硝化抑制剂的一种替代方案

《Frontiers in Plant Science》：Bacillus subtilis CECT30572 for biological fertilizer stabilization: an alternative to synthetic nitrification inhibitors

　　

摘要 引言： 现代集约化农业面临着氮肥利用效率降低以及与硝酸盐（NO3?）淋溶相关的严重环境影响的严峻挑战。尽管化学硝化抑制剂如3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）被广泛用于减少氮损失，但对可持续的、基于生物的替代品的兴趣日益增长。本研究调查了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CECT30572——商业氮稳定剂NSAFE?的活性生物成分——作为一种减少硝酸盐淋溶的微生物策略。 方法： 进行了混合全基因组测序以表征与氮代谢相关的基因。体外实验评估了硝酸盐消耗，并在对比土壤类型中使用不同的肥料配方进行了土柱淋溶实验。 结果： 混合全基因组测序揭示了一个保守的nasABCDEF簇以及与氮同化相关的调控元件（tnrA, glnR, codY, gltC）。该基因组还编码用于将硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO2?）的呼吸作用narGHJI操纵子，同时缺乏完全反硝化作用的典型基因（nirK/S, norBC, nosZ），表明其具有非反硝化的氮代谢特征。体外实验显示显著的硝酸盐去除效果，净消耗量为455 mg L?1 NO3?。从培养基中去除的硝酸盐并未主要以胞外或细胞相关的NH4+形式回收。虽然无法根据目前的测量确定其具体去向，但研究人员假设它可能已被细菌以氨基酸的形式同化。在对比土壤类型下的土柱淋溶实验表明，用CECT30572包膜或混合的肥料（颗粒状NP、颗粒状N、UAN）显著减少了累积的NO3?淋溶，在若干实验条件下其减少幅度与使用DMPP观察到的相似。 讨论： 总体而言，这些结果表明，在体外条件下观察到的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）CECT30572对硝酸盐的去除可能有助于在土柱中观察到的硝酸盐损失的减少，支持其作为减少硝酸盐淋溶的生物基策略的潜力。

论文解读文章

1. 研究背景

现代集约化农业高度依赖合成氮肥以满足全球粮食需求，但氮肥利用率（NUE）通常低于50%。这种低效性主要源于施用的铵态或尿素态肥料在土壤中通过自养氨氧化和亚硝酸盐氧化微生物介导的连续硝化过程，迅速转化为高度可移动的硝酸盐（NO₃^?）。由于硝酸盐的高溶解性和在土壤基质中的有限吸附性，极易发生淋溶损失，这不仅造成巨大的农学损失，还导致水体富营养化、地下水污染等严重的环境问题。

为缓解氮损失，农业上广泛采用化学氮稳定剂，其中合成硝化抑制剂如3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）通过抑制自养氨氧化菌的活性来延缓硝酸盐的形成。然而，这类化学抑制剂的效果受土壤温度、湿度等环境条件影响较大，且随着欧盟绿色协议等政策对减少合成农化投入品依赖的强调，开发能够提升肥料效率且环境友好的生物基替代品成为迫切需求。在此背景下，植物促生根际细菌（PGPR）被认为是极具前景的工具，尤其是芽孢杆菌属（Bacillus）因其代谢多样性、抗逆性强及能形成抗逆内生孢子等特点而备受关注。然而，关于微生物硝酸盐同化作为氮素保存策略的基因组基础、生理机制及农学意义的研究仍相对不足。

本研究聚焦于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CECT30572，它是商业肥料稳定剂NSAFE^?（Fertiberia公司）的活性生物成分。尽管先前田间观察证实该菌株能影响根际硝酸盐有效性从而减少氮损失，但其分子基础和生理机制尚不明确。因此，本研究旨在阐明该菌株硝酸盐同化的分子基础及其在农艺相关条件下对硝酸盐淋溶的影响。

2. 主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   混合全基因组测序与生物信息学分析：结合Oxford Nanopore长读长和Illumina短读长测序平台进行杂交测序，并使用Galaxy平台进行从头组装和功能注释。通过平均核苷酸一致性（ANI）、数字DNA-DNA杂交（dDDH）及系统发育组学分析进行基因组水平的分类鉴定。
2. 2.
   比较共线性分析：利用clinker软件对目标菌株与多个代表性芽孢杆菌物种的氮代谢相关基因簇进行基因组结构比较和可视化。
3. 3.
   体外硝酸盐同化动力学实验：在仅含硝酸盐（NO₃^?）为唯一氮源的最小培养基（NMM）中培养CECT30572，定时监测菌落形成单位（CFU）、硝酸盐、亚硝酸盐（NO₂^?）和铵（NH₄⁺）浓度变化。
4. 4.
   土柱淋溶实验：采用来自葡萄牙（S1）和西班牙（S2）两种不同理化性质的土壤，设计PVC管柱系统，评估在不同肥料形态（颗粒状NP、颗粒状N、液态UAN）下，CECT30572处理与DMPP处理及未稳定化对照相比，对五次模拟淋溶事件中硝酸盐淋失动态及累积量的影响。实验设置四个独立重复。

3. 研究结果

3.1 基因组测序、组装与一般特征

通过混合全基因组测序获得一个大小为4,095,377 bp的单一环化重叠群，GC含量为43.84%，无质粒序列。功能注释识别出4,044个编码序列（CDSs），基因组完整性高（BUSCO 99.1%，CheckM2 100%），污染率极低（0.02%）。

3.2 基于基因组的分类学鉴定

FastANI分析显示CECT30572与枯草芽孢杆菌模式菌株ATCC 6051的平均核苷酸一致性（ANI）为98.67%，dDDH值超过90%，系统发育树将其置于枯草芽孢杆菌分支内，确认其为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3.3 氮代谢簇的鉴定与基因组组织

基因组分析确认存在完整的nasABCDEF基因簇，负责硝酸盐/亚硝酸盐转运及还原为铵的同化途径。同时发现关键的全局调控因子（tnrA, codY, glnR）和铵转运系统（nrgAB）。值得注意的是，该菌株拥有呼吸性硝酸盐还原酶复合体（narGHJI）可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，但完全缺失将亚硝酸盐进一步还原为气态产物的反硝化途径关键酶基因（nirK/S, norBC, nosZ），表明其具备非反硝化的氮代谢特征。

3.4 氮代谢位点的比较共线性

与多株近缘芽孢杆菌的比较分析显示，CECT30572的核心同化氮代谢相关基因簇（nasABCDEF）、调控基因（tnrA, codY, glnR, gltC）及铵转运系统（nrgAB）在基因组位置和序列上均表现出高度的结构保守性。但在远缘物种普里斯特氏菌（Priestia megaterium）中则显示出广泛的差异，且在解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DSM 7的分析区域中未检测到nasBC同源物。

3.5 生长动力学与氮源消耗

在以硝酸盐为唯一氮源的体外实验中，菌株呈现典型的四相生长曲线。硝酸盐消耗与生长阶段密切相关，在203小时内净消耗约455 mg L^?1的NO₃^?。整个过程中，培养基中亚硝酸盐始终未被检出。胞外铵离子浓度保持低水平，总铵（主要为细胞内组分）在活跃生长期也维持基线水平，直至衰亡后期才有所增加。这表明去除的硝酸盐主要被细菌同化，而非转化为游离铵释放。

3.6 土柱中的硝酸盐淋溶

S1土壤（葡萄牙）：对于颗粒NP肥料，CECT30572包膜处理在第4次和第5次淋溶事件中显著降低了淋出液硝酸盐浓度，并在最终累积硝酸盐淋失量上显著低于常规对照，与DMPP效果相当。对于颗粒N肥料，两种稳定化处理（CECT30572和DMPP）均改变了淋溶动力学曲线，使峰值提前并随后下降，两者在最终累积淋失量上均显著低于常规对照，且彼此间无显著差异。

S2土壤（西班牙）：对于颗粒NP肥料，CECT30572处理在第2次淋溶事件中即显著降低了硝酸盐浓度，甚至优于DMPP；两者在最终累积淋失量上均显著低于常规对照。对于液态UAN肥料，CECT30572和DMPP处理均在第二次淋溶事件中显著降低了硝酸盐峰值浓度，两者在最终累积淋失量上均显著低于常规对照，且效果相近。

3.7 储存期间肥料配方中的活菌计数

在长达12个月的室温储存期内，CECT30572在颗粒NP和颗粒N肥料上的活菌数保持在10⁷ CFU g^?1水平，在液态UAN中保持在10⁶ CFU mL^?1水平，显示了其在肥料产品中良好的储存稳定性。

4. 讨论与结论

讨论总结： 本研究的核心发现是揭示了枯草芽孢杆菌CECT30572具备完整的同化硝酸盐还原（assimilatory nitrate reduction）的遗传基础，即nasABCDEF基因簇。该菌株的氮代谢为非反硝化型，意味着其吸收硝酸盐后将其同化为细胞组分（如氨基酸），而非通过反硝化途径将其转化为气态氮（N₂O, N₂）释放到大气中，这对于农业保氮具有重要意义。体外实验验证了其高效的硝酸盐清除能力，且中间产物亚硝酸盐和铵均未大量积累，支持了同化途径的主导地位。土柱淋溶实验进一步证明，无论是在颗粒还是液体肥料中应用，CECT30572均能有效减少不同土壤类型下的硝酸盐淋溶损失，其效果与广泛使用的化学硝化抑制剂DMPP相当。这证实了该菌株作为生物基肥料稳定剂的可行性，为减少农业面源污染和提升氮肥利用效率提供了一种可持续的替代方案。

研究结论翻译： 总体而言，这些结果表明，在体外条件下观察到的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）CECT30572对硝酸盐的去除可能有助于在土柱中观察到的硝酸盐损失的减少，支持其作为减少硝酸盐淋溶的生物基策略的潜力。