DNA条形码化多糖特异性单克隆抗体助力细胞壁聚合物的灵敏多重检测

《Plant Biotechnology Journal》：DNA-Barcoded Polysaccharide Specific Monoclonal Antibodies Facilitate Sensitive and Multiplexed Detection of Cell Wall Polymers

植物细胞壁是富含多糖的细胞外基质，由包括纤维素、半纤维素、果胶和糖基化蛋白在内的多种复杂碳水化合物聚合物网络组成。多糖沉积对细胞壁结构具有关键影响，细胞壁聚糖内部的结构微异质性同样影响聚合物刚性及聚合物-聚合物相互作用。目前已开发出单克隆抗体（mAbs）集合，用以靶向细胞壁多糖中独特的碳水化合物表位，并研究这些结构变化如何影响细胞及植物发育。本研究实施了一套可推广的方法，将独特的DNA条形码附着于识别主要细胞壁多糖类别的mAbs上。通过将上述mAbs单独应用于多糖标准品，研究证明可通过定量PCR（qPCR）测定结合的DNA条形码化抗体丰度。此外，研究证明DNA偶联抗体可混合使用，通过qPCR扩增其独特条形码，定量分析多糖标准品及分级细胞壁材料的多糖表位组成。上述结果表明，条形码化多糖导向mAbs可为细胞壁多糖组成提供灵敏、定量的信息，并促进细胞壁多糖丰度的多重谱分析。该方法还将支持多种未来的高通量应用，如糖组谱分析（glycome profiling）、空间糖组学（spatial glycomics）及聚糖相互作用测定，从而进一步加深对细胞壁组成影响植物生理机制的理解。

植物细胞壁是环绕所有植物细胞、富含多糖的复杂细胞外基质，对细胞膨胀、细胞分裂、植物细胞形态获得及细胞黏附等基本细胞过程具有关键影响。植物细胞壁聚糖大致可分为四大类：纤维素、半纤维素、果胶和糖蛋白。然而，细胞壁多糖的组成与精细结构在植物物种之间、同一生物体不同组织之间，或在环境扰动响应中可发生显著变化。据推测，细胞壁多糖组成及结构微异质性影响细胞壁力学行为的主要方面，但鲜有分析手段能够同时提供高结构分辨率与高空间分辨率以严格检验这一假说。由于植物细胞壁多糖具有显著的结构复杂性，研究人员已开发出单克隆抗体（mAbs）组库以识别植物细胞壁中特定的多糖表位。例如，复杂碳水化合物研究中心（CCRC）的mAb库包含150余种小鼠源mAbs，靶向几乎全部主要细胞壁多糖网络的碳水化合物表位。John Innes中心单克隆（JIM）与Leeds大学单克隆（LM）系列细胞壁抗体同样包含大量重叠及独特的探针，用于评估植物细胞壁多糖结构。其他实验室也制备了有价值的抗体，丰富了全球植物聚糖导向抗体库的规模与多样性。这些库中的mAbs可识别植物细胞壁多糖中极其细微的结构差异，如木葡聚糖的岩藻糖基化、木聚糖中葡萄糖醛酸的4-O-甲基化、果胶甲酯化程度以及多糖聚合度。上述独特探针已被用于多种应用，包括免疫组织化学研究固定组织中细胞壁多糖分布、对分离的细胞壁多糖及其降解产物进行免疫化学谱分析，以及对细胞壁结构改变的突变体进行谱分析。细胞壁mAb库结合自动化酶联免疫吸附测定（ELISA），亦被用于探测分级细胞壁多糖，以研究细胞壁代谢酶突变体、发育过程或环境变化响应中植物细胞壁糖组（glycome）的动态变化。在该方法中，总细胞壁材料（通常为醇不溶残渣；AIR）经一系列碱性逐渐增强的提取，逐步溶解细胞壁聚糖群体。分级的聚糖被固定于ELISA板中，并用80余种不同的细胞壁多糖导向mAbs探测，以测定提取细胞壁组分中mAb表位丰度的定量差异。糖组谱分析已为突变体、生物质作物乃至暴露于太空飞行的植物中细胞壁多糖组成变化提供了重要见解。然而，当前细胞壁多糖糖组谱分析的实施在大样本量高通量分析背景下仍存在若干关键局限。第一，该方法需要高度专业化的液体处理仪器，多数实验室难以获得，从而限制了范围与通量。第二，CCRC、JIM和LM库中的所有抗体均在小鼠或大鼠中制备，由于识别这些探针所需的物种特异性二抗要求，限制了单次反应中可多重化的探针数量。在其他体系中，替代性免疫学探针标记策略已实现更高通量分析与更高的样本多重化。例如，将特定DNA序列附着于抗体，可通过定量体外或空间方法评估抗原丰度。本研究力图通过将细胞壁多糖导向mAbs与寡核苷酸条形码标签偶联，规避传统糖组谱分析的关键局限。研究人员确定了一套将DNA条形码安装于纯化IgG型细胞壁多糖靶向mAbs的通用策略，并证明所考虑的原型mAbs在以qPCR作为检测方法时可识别低至0.25 ng的靶多糖标准品。研究人员还证明，条形码化mAbs在单独或成组应用于纯多糖标准品或其混合物时，均可识别其同源多糖靶标。最后，研究人员证明基于ELISA的细胞壁多糖丰度谱可通过该多重化方法忠实重现。

研究人员开展研究所用主要关键技术方法概述：研究通过Protein G亲和层析从杂交瘤上清中纯化CCRC-M23、CCRC-M38、CCRC-M58和CCRC-M140四种小鼠IgG1型mAbs；采用光辅助位点特异性偶联（LASIC）技术，利用含光交联氨基酸p-苯甲酰苯丙氨酸的DNA偶联蛋白Z变体，在365 nm紫外光下将独特DNA条形码共价安装至抗体Fc区，并以SDS-PAGE验证偶联；建立定量免疫PCR（qIPCR）流程，将多糖标准品或生物质组分固定于96孔PCR板，用条形码化抗体（单独或混合）探测，洗涤后以条形码特异性引物或M13引物进行qPCR定量；并以传统ELISA作为对照谱分析方法；所用分级细胞壁样品来源于拟南芥Col-0幼苗、Solanum pimpinellifolium LA1589果实和Panicum virgatum cv. Alamo茎的醇不溶残渣，分别经草酸铵（AO）、碳酸钠（SC）、1 M和4 M KOH（拟南芥另加温水HW提取）系列分级。

研究结果：2.1 植物细胞壁多糖表位导向抗体的DNA条形码化。研究人员选取CCRC-M23、CCRC-M38、CCRC-M58和CCRC-M140，分别选择性识别鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）、同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、木葡聚糖（XLG）和阿拉伯木聚糖（AX）中的独特表位。通过ELISA验证，各抗体对其同源多糖标准品显示最强信号且交叉反应极小，构成正交结合试剂组。研究设计含M13正向引物序列、独特20核苷酸条形码（BC1）、M13反向引物序列及第二个独特20核苷酸条形码（BC2）的DNA条形码结构，BC1与BC2序列选自酵母缺失文库条形码以保证最低退火交叉反应；qPCR证实各条形码引物对可正交扩增，CCRC-M23、M38和M140条形码对其靶模板的扩增量比脱靶模板高10万倍以上。随后以LASIC将DNA条形码连接至各mAb，SDS-PAGE显示各抗体均出现重链-LASIC试剂偶联物。将DNA条形码化CCRC-M23用于探测0.25–100 ng大豆RG-I，观察到qPCR扩增与循环阈值（Cq）的剂量依赖性下降，Cq值与抗原载量对数在10–0.25 ng间呈线性关系，表明条形码化mAb结合qPCR可灵敏检测低载量靶多糖。2.2 单个条形码化抗体的特异性评估。研究人员将10 ng各多糖标准品、等质量混合物（Mix）及无多糖对照（No PS）固定后分别用单个条形码化mAbs探测，以最大循环数（40）减去样品Cq值所得dCq作为定量输出。结果显示各条形码化mAb对其靶多糖均最早扩增，dCq较非靶样品高3–8个循环（9–256倍）；靶多糖单独或混合存在时dCq无统计学差异，CCRC-M23、M38和M140的非靶多糖dCq与无多糖对照无统计学差异。以2^?ΔΔCq计算线性相对丰度，CCRC-M23、M38、M58和M140对其靶多糖的扩增丰度分别比非靶多糖高100、13.4、18.3和49.5倍，混淆矩阵热图汇总了上述结果，表明该组条形码化mAbs对单独或混合靶多糖的扩增选择性为13–100倍。2.3 细胞壁mAbs多重化用于免疫PCR相对定量。研究人员将四种条形码化mAbs以0.5 μg/mL等浓度混合，探测各多糖标准品、等质量混合物及无多糖对照，再以条形码特异性引物qPCR定量结合抗体丰度。结果显示各引物组对同源抗体-多糖组合均较早扩增，例如CCRC-M140条形码引物在抗体池应用于含AX孔时提前5个循环扩增，非靶多糖的dCq一般与阴性对照相近，靶多糖单独与混合物间dCq几乎一致。经2^?ΔΔCq分析，CCRC-M23、M38、M58和M140相关扩增子在靶多糖上分别比非靶多糖高1634、11.8、22和40.6倍，靶多糖与混合物间倍数变化分别为0.76、0.97、1.03和0.62，表明混合条形码化细胞壁mAbs结合条形码选择性引物可以多重qPCR形式定量、选择性地报告各mAb相关表位的相对量。2.4 利用条形码化抗体定量分级细胞壁多糖。研究人员获取发育中番茄果实、拟南芥幼苗和柳枝稷茎的分级细胞壁多糖样品，先以未修饰mAbs行传统ELISA，所得反应模式与既往文献一致，如果胶表位在番茄和拟南芥的AO与SC组分中最丰富而在柳枝稷中几乎缺失，CCRC-M58在1 M/4 M KOH提取物中信号较高，CCRC-M140在柳枝稷1 M/4 M组分中显著富集。随后以50 ng样品固定并用混合条形码化mAbs行qIPCR，各抗体特异性引物扩增子的dCq值总体与相应抗体ELISA信号一致；将dCq与ELISA吸光度log₂（A₄₀₅）作线性回归，拟南芥、柳枝稷和番茄数据集的R²分别为0.65、0.69和0.78，表明qIPCR可提供与传统ELISA谱分析相似的生物质组分谱。此外，qIPCR可检出ELISA未能或难以检出的低丰度信号，如柳枝稷1 M KOH组分中的CCRC-M23和CCRC-M38表位以及番茄细胞壁顺序提取中的CCRC-M140表位，且所需样品投入量低10倍，提示该方法灵敏度提高。研究人员指出多糖丰度分布两端最高与最低信号比较时变异较大，但这些罕见偏差与单一组分、抗体或植物样品无关，推测为样品特异性误差所致。总体表明混合DNA条形码化mAbs可忠实重现并改进基于ELISA的糖组谱分析结果，实现对植物生物质样品细胞壁多糖表位丰度的快速定量。

讨论部分总结：多糖表位特异性抗体已支撑植物细胞壁生物学中诸多分析手段，包括糖组谱分析的全面自动化组成分析，但其样品通量受限于所需单个ELISA测定数量及完成这些任务所需仪器的可及性，尤其在大样本量高通量背景下。本研究利用区域选择性方法将独特DNA条形码安装于植物细胞壁多糖导向mAbs，证明以qPCR为检测手段时这些条形码化mAbs可识别低至0.25 ng载量的抗原；四种靶向不同细胞壁多糖独特表位的mAbs可在单独、多糖混合物及条形码化mAbs多重混合物中识别其同源抗原；条形码特异性序列扩增可实现混合样品中特定抗体的灵敏检测；混合mAb方法可对多种植物物种与组织的分级细胞壁样品进行谱分析，在样品载量降低10倍条件下重现传统ELISA表位谱，同时检测ELISA难以观察的低丰度碳水化合物表位特征。总体表明DNA条形码化多糖特异性抗体可作为灵敏有用的探针研究植物细胞壁多糖组成。讨论进一步指出，DNA片段与免疫学探针偶联已革新多种传统免疫学方法，如依赖DNA条形码化抗体实现单张组织切片40余种探针高维多重成像的空间蛋白质组技术CODEX，其通过循环流动荧光标记反义寡核苷酸结合同源条形码化mAb，不依赖二抗，只要DNA探针保持正交特异性即可大幅增加多重探针数目；邻近连接策略借助DNA标记抗体检测相邻蛋白表位，若抗原间距在40 nm以内，DNA链退火即可通过标准PCR或滚环扩增等检测空间相互作用；DNA条形码化mAbs或纳米抗体亦可用于蛋白抗原的多重定量，并以短读长测序作为检测手段实现单样品中众多条形码的高内涵定量。研究人员认为本工作为在植物细胞壁碳水化合物相关问题中采用这些先进、高通量、信息丰富的方法奠定了坚实基础，并提及近期哺乳动物体系中类似方法已用于N-和O-蛋白聚糖的多重定量及糖基化异常细胞的单细胞测序，提示植物体系亦可实现类似方法。该DNA序列促进的多重化策略还可扩展至其他碳水化合物结合探针以研究植物及其他生物细胞外基质动态，碳水化合物结合模块（CBMs）、凝集素及某些细胞外蛋白（如哺乳动物成纤维细胞生长因子、抗凝血酶）以高特异性、亲和力和选择性结合多糖，在这些探针上安装DNA条形码可扩大所分析多糖的范围；传统标记化学可实现该策略，而蛋白连接方法如分选酶或天冬酰胺酰内肽酶介导的连接可能为探针安装提供更高特异性、区域选择性和灵活性。总体而言，本研究结果凸显了基于DNA条形码的多重分析植物细胞壁多糖的关键方面，并建立了扩展该方法以进行广泛细胞壁碳水化合物结构谱分析的框架；尽管本研究涉及的mAb数量相对较少，但足以证明基于条形码化抗体的检测可在更低样品投入、有效抗体多重化且结合表位间无交叉干扰的条件下实现。该方法适用于需以少量抗体探测大量样品、需要少量靶向单一聚合物不同结构特征的mAbs、或生物质样品量极为有限的实验，此时少量抗体的mAb多重化可通过TaqMan型探针实现。研究人员认为大幅增加检测中条形码化mAbs数量并采用高通量测序方法定量条形码丰度与多样性具有巨大价值，将朝此目标努力，本研究是证明细胞壁多糖特异性抗体mAb条形码化将促成该未来技术的重要一步。研究结论翻译：总体而言，本文所呈现的结果凸显了基于DNA条形码的多重分析植物细胞壁多糖的关键方面，并建立了扩展该方法以进行广泛细胞壁碳水化合物结构谱分析的框架。

（论文发表于《Plant Biotechnology Journal》）