番茄CNGC16自然变异通过CaM6介导的钙信号调控果实重量

《Plant Biotechnology Journal》：Natural Variation in CYCLIC NUCLEOTIDE-GATED ION CHANNEL 16 Controls Fruit Weight in Tomato

　　

果实重量是影响番茄驯化中产量和品质的关键农艺性状。尽管已有大量控制果实重量的数量性状位点（quantitative trait loci，QTLs）被报道，但其潜在分子机制在很大程度上仍未阐明。本研究中，研究人员通过全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）在番茄种质中鉴定到环核苷酸门控离子通道16（cyclic nucleotide-gated ion channel 16，CNGC16）启动子区的自然变异，该变异与果实重量和基因表达差异均相关。地理和亚群分析表明，大果CNGC16单倍型在驯化过程中被选择性青睐，并可能有助于局部环境适应。功能实验表明，CNGC16通过促进细胞分裂和维持果实细胞中胞质Ca²⁺稳态来调控果实重量。在机制上，CNGC16与钙调蛋白6（calmodulin 6，CaM6）发生物理和遗传互作，介导控制果实大小的钙信号。这些发现揭示了一条调控番茄果实重量的新型钙依赖通路，并提出CNGC16和CaM6作为作物改良的有前景的分子靶标。

果实重量是决定番茄产量和品质的重要农艺性状。在番茄驯化进程中，果实大小经历了剧烈变化，野生醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium，SP）果实仅约1克，而栽培种番茄（Solanum lycopersicum）果实可达1公斤以上。尽管过去已定位约30个果实重量相关数量性状位点（quantitative trait loci，QTLs），但仅有fw2.2、fw3.2等少数基因被克隆，其调控网络仍不清楚。钙离子（Ca²⁺）作为第二信使广泛参与植物发育，环核苷酸门控离子通道（cyclic nucleotide-gated channel，CNGC）是介导Ca²⁺内流的关键通道家族，然而CNGC在果实发育，尤其是基础钙稳态维持中的作用尚未阐明。因此，研究人员利用自然群体开展全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），以期鉴定调控番茄果实重量的新基因并解析其分子机制。

在本研究中，研究人员通过GWAS在163份番茄种质中鉴定到CNGC16启动子自然变异与果实重量显著相关，并通过功能实验证实CNGC16与钙调蛋白6（calmodulin 6，CaM6）相互作用，经钙信号通路调控果实重量。该研究发表在《Plant Biotechnology Journal》，为理解番茄驯化中果实增大的遗传基础提供了新视角，也为果实性状改良提供了潜在分子靶标。

主要技术方法方面，研究人员使用了来自美国农业部（USDA）的163份番茄种质资源（包括SP、Solanum lycopersicum var. cerasiforme（SLC）和Solanum lycopersicum（SLL）），利用GWAS（混合线性模型）鉴定显著关联位点；采用双荧光素酶报告系统检测启动子活性；通过CRISPR-Cas9基因编辑和转基因过表达分别获得功能缺失和增强材料；利用YC3.6钙离子传感器进行胞质Ca²⁺成像；采用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）、酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）验证蛋白互作；并结合AlphaFold3和HDOCK进行结构预测；表达分析采用RNA-seq和RT-qPCR。

研究结果如下：

2.1 CNGC16基因与果实重量相关：通过重新分析163份番茄种质的GWAS数据，研究人员在8条染色体上检测到352个显著多态性位点，其中包含已知的fw7.2和fw11.3，验证了检测效率。在2号染色体上，领先SNP附近约80 kb处定位到候选基因CNGC16（Solyc02g088560），其启动子区含有12个多态性（9个SNP和3个插入缺失），构成两个主要单倍型Hap1和Hap2；携带Hap1的种质果实重量显著高于Hap2，表明CNGC16自然变异与果实重量相关。

2.2 启动子区自然变异赋予CNGC16表达差异：RNA-seq和RT-qPCR分析显示，Hap1型材料中CNGC16表达量显著高于Hap2型。双荧光素酶实验证明，Hap1启动子驱动的荧光素酶活性是Hap2启动子的2.4倍，说明启动子多态性直接导致表达差异。

2.3 过表达CNGC16增加果实大小：在Ailsa Craig（AC）背景中过表达CNGC16，两个独立株系（OE#4和OE#7）的果实重量、纵径和横径均显著增加，表明CNGC16正调控果实大小。

2.4 CNGC16功能缺失减小果实大小：利用CRISPR-Cas9创制了3个cngc16突变体，其果实重量和果实直径均显著低于野生型。组织学分析显示，过表达株系果皮细胞层数增加，突变体细胞层数减少，而细胞面积无显著差异，表明CNGC16通过影响细胞分裂而非细胞扩张来调控果实大小。

2.5 CNGC16启动子自然变异导致果实大小差异：将Hap1和Hap2启动子分别与CNGC16编码区融合后转化cngc16-1突变体，Hap1启动子驱动的株系果实显著增大，而Hap2启动子驱动的株系果实与野生型相似，证实启动子自然变异是果实大小差异的遗传基础。

2.6 CNGC16等位基因的地理分布：地理分布分析显示，Hap1主要分布在高纬度和低经度地区，Hap2则常见于秘鲁、哥伦比亚和厄瓜多尔等番茄驯化中心。在亚群中，Hap1频率在野生种SP中为36%，在半栽培种SLC中为91%，在栽培种SLL中为100%，表明Hap1在驯化过程中受到强烈选择。

2.7 CNGC16、FW11.3和FW7.2协同调控果实大小：单倍型分析表明，这3个位点的大果等位基因组合产生最大果实，而小果组合产生最小果实，说明它们协同促进果实增大，可作为果实改良的分子标记。

2.8 CNGC16缺失增加果实细胞胞质Ca²⁺：利用YC3.6钙传感器进行体内成像，发现cngc16-1突变体果实细胞中胞质Ca²⁺浓度显著升高。转录组分析显示，突变体中液泡钙转运蛋白CAX3表达下调，而质膜钙通道CNGC13表达上调，提示CNGC16缺失可能通过反馈调节破坏钙稳态。

2.9 CNGC16与CaM6物理互作：BiFC、Y2H和Co-IP实验均证实CNGC16与CaM6在质膜上发生物理互作；AlphaFold3和HDOCK预测了二者的结合界面，共鉴定出14对形成氢键的氨基酸残基。

2.10 CaM6增加番茄果实重量：CaM6过表达株系果实重量和体积显著增加，而cam6突变体果实显著减小。组织学分析表明CaM6同样通过影响细胞分裂调节果实大小。遗传互作分析显示，cngc16cam6双突变体表型与单突变体相似，且CaM6缺失可抑制CNGC16过表达引起的果实增大，表明CNGC16的功能部分依赖CaM6。

综上所述，该研究首次提供了钙信号参与番茄果实重量调控的直接证据。讨论指出，cngc16突变体胞质Ca²⁺升高的现象可能与CAX3和CNGC13的转录变化有关，形成反馈调节以维持钙稳态。CNGC16与CaM6的互作模块将钙信号与细胞分裂联系起来，而CNGC16启动子自然变异则受到驯化选择并呈地理分化，可能有助于局部适应。研究结论可翻译为：这些发现揭示了一条调控番茄果实重量的新型钙依赖通路，并提出CNGC16和CaM6可作为作物改良的有前景的分子靶标。