甘草酸通过抑制病毒复制与免疫调控发挥抗牛病毒性腹泻病毒作用的研究

《Frontiers in Microbiology》：Antiviral mechanism of glycyrrhizic acid against BVDV: suppression of viral replication and immune regulation

　　

摘要 引言：牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）是一种全球流行的牛类病原体，通过急性腹泻、免疫抑制和繁殖障碍造成严重经济损失，在持续感染牛群中死亡率可达20%–30%。本研究探讨了甘草酸（Glycyrrhizic acid, GA）——一种源自甘草根、具有已知抗炎和广谱抗病毒活性的生物活性三萜糖苷——作为BVDV复制潜在抑制剂的作用。 方法：研究人员采用体外（MDBK细胞）和体内（BALB/c小鼠）模型评估GA的抗病毒和免疫调节效应。细胞接受10 μM GA处理，小鼠接受20 mg/kg/天GA给药。研究评估了病毒复制、细胞因子表达、肝脏组织病理学和肠道菌群。 结果：GA处理显著降低BVDV复制，使5'UTR和NS5B mRNA表达减少>80%（P < 0.01），肝脏组织中病毒滴度降低2.3个对数。GA同时调节宿主免疫应答，抑制促炎细胞因子（TNF-α降低68%，IL-6降低54%），同时升高IL-10（2.1倍），并显著改善肝脏组织病理学评分（P < 0.05，与感染对照组相比）。ELISA检测显示GA介导感染期间IFN-β的下调。感染后第7天的肠道菌群分析显示，GA和利巴韦林（Ribavirin, RBV）处理均调节微生物群落结构，其中RBV处理的菌群谱更接近未感染对照组。 讨论：这些发现确立了GA的双重抗病毒机制——直接抑制病毒RNA合成和免疫调节——使这一天然化合物成为针对家畜BVDV感染的有前景的治疗候选药物。

论文解读：甘草酸抗牛病毒性腹泻病毒的双重机制研究

一、研究背景与问题

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）隶属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），是全球养牛业最具经济意义的病原体之一。该病毒通过急性感染（以腹泻、发热和免疫抑制为特征）以及持续性感染（导致繁殖障碍和犊牛先天性缺陷）造成重大经济损失。全球血清阳性率研究显示，牛群感染率为60%–90%，因生产力下降、提前淘汰和贸易限制造成的年经济损失超过30亿美元。当前防控策略主要依赖疫苗接种和持续感染动物的识别与清除，尚无特异性抗病毒疗法商业化可用。虽然存在减毒活疫苗和灭活疫苗，但其效力受病毒遗传多样性和无法预防胎儿感染的限制。这些关键缺口凸显了开发新型、安全的BVDV抗病毒药物的迫切需求。

天然产物因其结构多样性和低毒性特征而成为抗病毒化合物的重要来源。甘草酸（Glycyrrhizic acid, GA）是甘草根中主要的生物活性三萜皂苷，具有已确立的安全性特征和广谱抗病毒活性。体外研究一致显示GA低细胞毒性，浓度高达100 μM时各细胞系仍保持>90%细胞活力。动物研究进一步确认其安全性，小鼠可耐受高达50 mg/kg剂量而无不良效应。与常规抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin, RBV）相比——后者可引起溶血性贫血和致畸性——GA的安全优势使其在兽医应用中特别具有吸引力。GA已对多种病毒显示出强效抗病毒效应，包括SARS-CoV-2、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）和呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV），机制包括直接杀病毒活性、抑制病毒进入或复制，以及通过抑制NF-κB介导的炎症或增强干扰素应答进行免疫调节。然而，GA对BVDV的潜在作用此前尚未被探索，这代表了兽医抗病毒研究中的重要空白。

基于GA已确立的安全特征和广谱抗病毒活性，研究人员假设其可能代表一种针对BVDV感染的新型治疗策略，具体通过双重机制发挥抗BVDV效应：（1）通过干扰关键病毒组分（如5'UTR基因组区域或NS5B聚合酶）直接抑制病毒复制；（2）通过调节干扰素和细胞因子应答调控宿主抗病毒免疫。该研究首次系统调查了GA对BVDV的抗病毒潜力，特别侧重于阐明其分子作用机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用体外（MDBK细胞）和体内（BALB/c小鼠）模型系统评估了GA的抗病毒和免疫调节效应。体外实验中，细胞接受10 μM GA处理；体内实验中，小鼠接受5或20 mg/kg/天GA口服给药，持续7天。研究评估了病毒复制、细胞因子表达、肝脏组织病理学和肠道菌群。结果表明，GA处理显著降低BVDV复制，减少5'UTR和NS5B mRNA表达>80%，肝脏组织中病毒滴度降低2.3个对数。GA同时调节宿主免疫应答，抑制促炎细胞因子（TNF-α降低68%，IL-6降低54%）并升高IL-10（2.1倍），显著改善肝脏组织病理学评分。GA的抗病毒效力与RBV相当，但安全性更优。此外，16S rRNA测序和功能预测显示，GA不仅重塑肠道菌群结构，还恢复了BVDV诱导的短链脂肪酸（Short-chain fatty acids, SCFA）合成途径抑制，并抑制NF-κB促炎信号通路。

这项研究的重要意义在于首次确立了GA对BVDV的双重抗病毒机制——直接抑制病毒RNA合成和免疫调节——将该天然化合物定位为针对家畜BVDV感染的有前景治疗候选药物，为当前有限治疗选择提供了急需的替代方案。

三、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：（1）CCK-8细胞毒性测定法，用于评估GA和RBV在MDBK细胞中的安全性并确定非毒性工作浓度；（2）定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），用于检测病毒RNA（5'UTR和NS5B区域）和宿主细胞因子mRNA表达；（3）酶联免疫吸附测定（ELISA），用于定量IFN-β蛋白水平；（4）体内小鼠感染模型，使用雌性BALB/c小鼠（6–8周龄，每组10只），通过腹腔注射BVDV NADL株（1×10? PFU/只）建立感染，感染后24小时开始口服给药治疗；（5）苏木精-伊红（HE）染色组织病理学评估，由两名盲法病理学家对肝脏损伤进行评分；（6）16S rRNA基因测序（V4-V5高变区，Illumina MiSeq平台），结合QIIME2生物信息学分析和Tax4Fun2功能预测，用于肠道菌群组成和代谢功能分析。样本来源于宁夏农林科学院动物科学研究所保藏的细胞和病毒资源，动物实验经宁夏大学动物伦理委员会批准（批准号NJAULLSC2024024）。

四、研究结果

3.1 GA在MDBK细胞中表现出低细胞毒性

通过CCK-8测定法评估GA和RBV在MDBK细胞上的细胞毒性。结果显示，GA在浓度≤10 μM时无显著细胞毒性，维持>95%细胞活力；当浓度超过15 μM时开始表现出轻度细胞毒性。RBV在15 μM时确认为无毒浓度，保持>90%细胞活力，而≥20 μM浓度导致细胞活力显著下降。基于这些结果，选择10 μM GA和15 μM RBV作为后续体外抗病毒实验的工作浓度。

3.2 GA在体外强效抑制BVDV复制

在MDBK细胞中评估GA对BVDV的体外抗病毒活性。qRT-PCR结果显示，与BVDV感染对照组相比，GA处理在所有时间点均显著降低BVDV 5'UTR和NS5B mRNA表达水平（P < 0.01）。在病毒复制高峰期（24 hpi），GA抑制5'UTR和NS5B mRNA表达>80%，与RBV的抑制效果相当。病毒滴度分析进一步确认了GA的抗病毒效力：GA处理细胞中BVDV滴度在24 hpi降低2.1个对数，在48 hpi降低2.3个对数。时间过程分析显示GA发挥持续抑制效应，即使在48 hpi病毒复制仍保持抑制状态。

3.3 GA在体内减轻BVDV诱导的病理损伤

通过BALB/c小鼠模型评估GA对BVDV诱导组织损伤的体内保护效应。组织病理学观察显示，BVDV感染对照组表现出严重肝损伤：中央静脉周围明显淋巴细胞和中性粒细胞浸润、肝细胞水肿（胞质空泡化）和散在肝细胞坏死，平均组织病理学评分为7.2 ± 0.8。相比之下，GA处理剂量依赖性减轻这些病理变化：低剂量GA组（5 mg/kg）显示轻度肝细胞水肿和减少的炎性细胞浸润（评分4.5 ± 0.6），而高剂量GA组（20 mg/kg）几乎恢复正常肝脏形态，肝板排列整齐，评分仅为2.1 ± 0.3。RBV组显示类似保护效应（评分2.3 ± 0.4）。

3.4 GA调节宿主免疫应答

通过检测MDBK细胞上清液和小鼠血清/肝组织中的关键细胞因子表达评估GA对宿主免疫应答的效应。体外实验中，与BVDV感染对照组相比，GA处理在24 hpi显著下调促炎细胞因子TNF-α（降低68%）和IL-6（降低54%）的mRNA表达，同时上调抗炎细胞因子IL-10（2.1倍）。ELISA结果显示，GA处理细胞上清液中IFN-β水平在所有时间点均显著低于感染对照组。体内实验中，小鼠血清细胞因子分析显示一致趋势：BVDV感染对照组在感染后第8天TNF-α（2.8倍）和IL-6（3.1倍）水平显著升高，而GA（20 mg/kg）将这些水平降至接近正常（TNF-α：1.2倍，IL-6：1.3倍），并增加IL-10（1.8倍）。小鼠血清IFN-β遵循类似模式：感染对照组IFN-β水平高（120 ± 10 pg/mL），而GA和RBV处理分别将其降至55 ± 6 pg/mL和58 ± 7 pg/mL。肝组织qRT-PCR进一步确认了这些发现。

3.5 与利巴韦林的疗效比较

将GA的抗病毒效力与RBV进行比较。体外实验中，10 μM GA和15 μM RBV对BVDV复制表现出相当的抑制效果：GA抑制5'UTR/NS5B mRNA>80%和病毒滴度2.3个对数，而RBV抑制mRNA约78%和滴度2.2个对数。然而，GA表现出更好的安全性：10 μM GA维持>95%细胞活力，而15 μM RBV仅维持约90%活力。体内实验中，高剂量GA（20 mg/kg）和RBV（20 mg/kg）在降低病毒载量和减轻肝脏病理方面效果相似，但GA表现出更优的免疫调节作用：GA上调IL-10达2.1倍（体外）和1.8倍（体内），而RBV仅上调1.5倍（体外）和1.4倍（体内）。此外，RBV在动物中有已报道的副作用（如溶血性贫血和致畸性），而GA在小鼠中即使50 mg/kg也未显示不良效应。

3.6 GA对BVDV感染小鼠肠道菌群组成的调节效应

3.6.1 α多样性分析显示BVDV感染影响温和而处理效应各异

在感染后第7天进行α多样性分析。与预期相反，BVDV感染对微生物群落多样性仅显示温和效应。BVDV感染组的Chao1指数（275 ± 12）与阴性对照组（291 ± 11）无显著差异，Shannon指数也显示可比值。值得注意的是，GA处理导致Shannon指数降低（5.65 ± 0.37），表明GA干预后群落均匀度下降。相比之下，RBV处理维持最接近对照组的多样性指数。

3.6.2 β多样性分析揭示菌群结构改变及GA的中间状态恢复

基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）显示，BVDV感染后肠道菌群组成发生结构改变，阴性对照组与BVDV感染组之间部分分离（ANOSIM，R = 0.68，P = 0.001）。GA处理显示介于BVDV感染组和对照组之间的中间聚类模式，提示菌群结构部分恢复。RBV处理的聚类模式更接近阴性对照，显示比GA处理更好地保留了正常菌群结构。

3.6.3 分类组成显示处理特异性调节模式

门水平分类分析显示各处理组间微生物组成改变。GA处理显示独特的门水平谱，与BVDV感染组和对照组均不同。属水平上，GA处理对不同细菌种群显示可变效应，对某些类群显示介于BVDV感染状态和对照状态之间的中间模式。RBV处理通常显示更接近阴性对照的属水平谱。

3.6.4 差异丰度分析识别处理特异性微生物特征

线性判别分析效应大小（LEfSe）分析识别了区分不同处理组的特征细菌类群。BVDV感染与特定细菌类群相关，GA处理显示独特的微生物特征，与感染组和对照组均不同，提示对肠道微生物群落具有特异性调节效应。RBV处理以其自身独特的特征类群为特征。

3.6.5 GA调节与SCFA合成和炎症抑制相关的肠道菌群代谢途径

通过Tax4Fun2和KEGG注释分析肠道菌群代谢途径。BVDV感染显著破坏微生物代谢相关途径：与阴性对照相比，BVDV感染组碳水化合物代谢相对丰度降低42%，SCFA合成亚途径（丁酸代谢、丙酸代谢）特异性下降，而免疫疾病途径（如NF-κB信号通路）富集。GA处理剂量依赖性逆转这些失调：高剂量GA（20 mg/kg）将丁酸代谢恢复至1.38%，丙酸代谢恢复至1.05%，同时将NF-κB信号通路丰度降低至1.12%。RBV处理显示部分恢复但未能使炎症途径正常化。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分将研究结果置于现有研究背景中。体外实验揭示10 μM GA显著降低BVDV复制，与GA对其他黄病毒科成员的既有抗病毒活性一致。GA的抑制效力与15 μM RBV相当但安全性更好。体内实验中，高剂量GA剂量依赖性减轻BVDV诱导的肝损伤，这种保护与GA的免疫调节效应密切相关，解决了BVDV感染驱动的细胞因子风暴。GA显著下调促炎细胞因子并上调抗炎细胞因子IL-10，同时降低IFN-β水平——并非通过直接抑制IFN-β分泌，而是通过抑制病毒复制（RIG-I/MDA5-IFN途径的主要触发因素）。与RBV相比，GA表现出更优的免疫调节作用。研究局限性包括使用BALB/c小鼠而非牛（BVDV天然宿主）、GA与BVDV相互作用的机制部分未解、体外实验仅依赖致细胞病变BVDV NADL株、仅测量IFN-β作为代表性I型干扰素。未来研究方向包括在牛原代肝细胞或牛源细胞系中验证GA效力、在牛中进行体内试验、使用分子技术识别GA的直接结合靶点、开发适合家畜给药的GA制剂。

研究结论部分翻译如下：本研究系统确立了甘草酸（GA）作为针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染的有前景治疗候选药物，并对其调节肠道菌群-代谢-免疫轴提供了新见解。体外实验中，10 μM GA在MDBK细胞中显示可忽略的细胞毒性（>95%活力），但强效抑制BVDV复制，在感染高峰期将病毒5'UTR和NS5B mRNA表达降低超过80%，病毒滴度降低2.3个对数。体内实验中，感染后7天口服GA 20 mg/kg/天剂量依赖性减轻BVDV诱导的肝脏病理，恢复接近正常的肝脏形态，并减轻炎性细胞浸润。免疫学上，GA下调促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）和IFN-β，同时上调抗炎细胞因子IL-10，避免病理性细胞因子风暴。关键的是，16S rRNA测序和功能预测显示GA不仅重塑肠道菌群结构，还恢复微生物代谢功能：逆转BVDV诱导的SCFA合成途径抑制并抑制促炎信号（NF-κB途径），为免疫稳态创造协同的菌群-代谢支持。虽然RBV处理显示更接近未感染对照组的菌群谱，但GA与RBV的抗病毒效力相当，却表现出更优的安全性（无溶血/致畸风险）和对菌群-免疫轴更全面的调节。总体而言，这些临床前发现——涵盖抗病毒活性、免疫调节和菌群-代谢调节——有力支持GA作为安全有效的家畜用药物的进一步开发，具有减少全球养牛业BVDV巨大经济负担的潜力。