《Frontiers in Pharmacology》：Integrating tissue proteomics and bioactive lipid analysis of ovine tissue samples identifies functional relations of bioactive lipids
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摘要
生物活性脂质（bioactive lipids）是有效的效应分子，可能有助于揭示生物过程的具体信息。然而，分析挑战和不完整的功能注释仍然是障碍。研究人员假设，通过将源自蛋白质组学的富集基因本体论（Gene Ontology, GO）术语投射到相关的生物活
摘要
生物活性脂质（bioactive lipids）是有效的效应分子，可能有助于揭示生物过程的具体信息。然而，分析挑战和不完整的功能注释仍然是障碍。研究人员假设，通过将源自蛋白质组学的富集基因本体论（Gene Ontology, GO）术语投射到相关的生物活性脂质上，可以改善这些脂质的功能注释。为此，研究人员使用基于质谱的非靶向蛋白质组学和生物活性脂质分析，分析了绵羊（Ovis aries）的十三个器官和组织。总共鉴定出4717种蛋白质和168种生物活性脂质，包括脂肪酸及其缀合物、氧脂素（oxylipins）（十八烷酸类、二十烷酸类和二十二烷酸类）、溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholines, LPCs）和溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-phosphatidylethanolamines, LPEs）、内源性大麻素及相关脂肪酸酰胺、胆汁酸及相关甾醇脂质。其中，使用市售分析标准品确认了114种脂质的正确鉴定，而先前未表征的氧脂素4-羟基二十碳四烯酸（4-hydroxy-eicosatetraenoic acid, 4-HETE）的身份则通过内部化学合成得到验证。共表达和聚类分析与研究人员的假设一致，独立证实了已知的生物活性脂质功能，并提出了新的功能关联。在其他观察结果中，18-HETE和19-HETE与线粒体脂肪酸β-氧化相关，11,12-二羟基二十碳四烯酸（11,12-dihydroxy-eicosatetraenoic acid, DiHETE）、15-脱氧前列腺素J2和5(6)-环氧二十碳三烯酸（5(6)-epoxy-eicosatrienoic acid, EET）与化学突触传递相关，花生四烯酰乙醇酰胺磷酸盐与肌肉收缩相关，众多LPCs和LPEs与外泌体形成相关。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）、促消退介质和新表征的4-HETE的组织水平与细胞蛋白质合成和折叠机制相关。后一发现表明，PUFAs及其衍生物除了支持胞葬作用（efferocytosis）外，还支持蛋白质合成保真度，这两者都是有效消退炎症的关键贡献因素。
研究背景与目的
代谢活动与调控细胞活动的信号传导和转录网络密切相关。细胞代谢谱随底物可用性及细胞生命周期变化，以支持其分化、衰老或应激时的功能角色。然而，目前关于相关代谢物及其功能意义的数据仍然匮乏，且代谢组学研究主要集中于高能量需求组织（如骨骼肌、心肌、脑、肝、肾），对由静止细胞组成的缓慢代谢组织（如软骨、肌腱）关注甚少。生物活性脂质（如氧脂素、胆汁酸、内源性大麻素）是既可作代谢物又可作信号分子的效应分子，可能作为特定生物过程实际执行的指标。尽管LC-MS/MS技术极大推动了此类分子的分析平台建设，但分析挑战和功能注释不完整仍是主要障碍。本研究基于两个假设：其一，不同类型的器官和组织与特定且众所周知的生物过程相关，这些过程同时影响蛋白质组和代谢组；其二，组织中检测到的生物活性脂质丰度或分子模式与特定生物过程的活性状态相关。因此，通过将同一批组织样本的蛋白质组学数据中提取的生物过程与生物活性脂质模式进行跨器官组织关联分析，应能将生物活性脂质与生物过程联系起来。研究人员选用绵羊（Ovis aries）作为大动物模型，因其体型、体重和器官尺寸与人类接近，且为长寿物种。本研究旨在通过整合质谱-based生物活性脂质分析和蛋白质组学方法，系统研究十二种不同代谢活性的器官组织及血浆中的生物活性脂质指纹图谱，并探索其与生物学功能的关联。
研究内容与主要发现
研究人员对三只健康成年雌性美利奴绵羊的十二种器官组织（脑、心、肾皮质、肾髓质、肝、肺、肌肉、神经、皮肤、脾、肌腱、软骨）及血浆进行了非靶向蛋白质组学和生物活性脂质分析。共鉴定出4717种蛋白质和168种生物活性脂质，其中114种通过市售标准品确认，并首次通过化学合成验证了先前未表征的氧脂素4-HETE的结构。研究发现生物活性脂质呈现组织特异性表达模式，如DGLA-EA主要存在于脑、甘氨脱氧胆酸主要存在于肝、PGE2主要存在于肾髓质、皮质醇主要存在于血浆。共表达网络分析（WGCNA）形成27个模块，其中18个模块成功将蛋白质与生物活性脂质关联。模块分析验证了已知知识（如CYP单加氧酶与其产物在肝脏模块中共表达），并发现了多个新关联：18-HETE和19-HETE与线粒体脂肪酸β-氧化相关；11,12-DiHETE、15-脱氧PGJ2和5(6)-EET与化学突触传递相关；花生四烯酰乙醇酰胺磷酸盐与肌肉收缩相关；多种LPCs和LPEs与外泌体形成相关。值得注意的是，PUFAs及其衍生物（包括新表征的4-HETE）与细胞蛋白质合成和折叠机制相关，提示PUFAs可能通过支持内质网伴侣功能和蛋白质合成保真度，与胞葬作用协同促进炎症消退。
关键技术与方法
研究人员采用以下主要技术方法：基于timsTOF Pro质谱仪的平行累积连续碎裂（PASEF）模式进行非靶向蛋白质组学分析，使用MaxQuant软件（版本1.6.17.0）结合Andromeda搜索引擎进行蛋白质鉴定，以UniProt数据库为参考；生物活性脂质分析采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，使用Vanquish? UHPLC系统耦合Q Exactive? HF高分辨率四极杆轨道阱质谱仪，通过TraceFinder软件进行相对定量；4-HETE通过内部化学合成并经GC-MS验证；采用加权基因共表达网络分析（WGCNA，β=6，deepsplit=4，Pearson相关，最小模块大小30）整合蛋白质组和脂质组数据，并使用clusterProfiler 4.0 R包进行基因本体论（GO）术语富集分析和语义相似性分析。样本来源于三只健康成年雌性绵羊，血浆经EDTA抗凝采集，组织样本采集后立即液氮冷冻或置于冰冷乙醇中保存。
研究结果
3.1 生物活性脂质的鉴定与相对定量，包括先前未表征的4-HETE
通过高分辨率质谱和114种分析标准品验证，在至少一种组织类型的所有三个重复中可靠鉴定出168种不同分子。另有40种分子被鉴定为身份不确定的氧脂素，其中之一通过化学合成和LC-MS分析被确认为4-HETE，该化合物此前未列入LIPID MAPS数据库，现已收录（LMFA03060123）。
3.2 生物活性脂质呈现组织特异性表达模式
部分分子如脱氧胆酸特异性低，而DHA异构体I仅在血浆中检测到。多种分子呈现组织特异性分布：DGLA-EA主要分布于脑，甘氨脱氧胆酸主要分布于肝，PGE2主要分布于肾髓质，皮质醇主要分布于血浆，α-亚麻酰乙醇胺主要分布于脾，LPE(0:0/18:2)主要分布于心脏，8(9)-EET主要分布于肾皮质，13,14-二氢-15-酮-PGF2α主要分布于肺，LPE(0:0/16:0)主要分布于神经组织，苏式-9,10-DiHOME主要分布于皮肤。
3.3 游离PUFAs和PUFA衍生物水平在器官类型间相关
AA和DHA在肾皮质、肝和脑中水平较高，在肺、神经、皮肤、脾和肾髓质中居中，在软骨、心、肌肉和肌腱中最低。相应LPC分子和内源性大麻素水平与基础PUFA水平相关，但存在例外，如心脏组织中LPC(0:0/20:4)水平高于基于AA水平预期的值，提示组织特异性代谢过程。
3.4 生物活性脂质关联分析表明功能相关性
聚类分析将氧脂素按前体脂肪酸和合成酶分类，形成两个主要组织簇（高脂质水平簇和低脂质水平簇）及血浆簇。心脏属于高脂质水平簇而骨骼肌属于低脂质水平簇，提示两种肌肉组织脂质代谢存在显著差异。麻醉剂embutramide在心脏、肺和脑中高效蓄积而血浆中几乎检测不到。
3.5 蛋白质组谱的组织类型功能表征
经筛选后，每种组织类型鉴定出171（软骨）至2761（脑）种蛋白质，总计4717种蛋白质。脑组织富集分析显示“神经元突起”和“细胞内信号转导”等过程过表达，突触前膜、突触囊泡和突触被鉴定为连接大量特征蛋白的枢纽术语。
3.6 蛋白质组谱与生物活性脂质谱的主成分分析
蛋白质组和生物活性脂质数据的主成分分析均显示按器官或组织类型的清晰聚类。肌肉、软骨和肌腱在两种PCA中均远离其他组织。脑和神经组织在蛋白质组水平上明显分离，但在生物活性脂质水平上聚集在一起。
3.7 生物活性脂质和蛋白质的共表达分析揭示功能关联
共表达分析形成27个模块，其中18个模块成功关联蛋白质与生物活性脂质。模块M8验证了CYP单加氧酶产物（DiHETrE、DiHETE、DiHDPA等）与其酶在肝脏特异性共表达，证实了方法的可靠性。模块M2将低水平PUFAs及其CYP衍生物与低水平细胞质翻译和内质网功能蛋白关联；模块M3将18-HETE和19-HETE与线粒体脂肪酸β-氧化关联；模块M1将11,12-DiHETE、15-脱氧PGJ2和5(6)-EET与化学突触传递关联；模块M18将花生四烯酰乙醇酰胺磷酸盐与肌肉收缩关联；模块M26将多种LPCs和LPEs与外泌体形成关联。
讨论与结论
本研究首次系统性地将组织生物活性脂质表达特征与蛋白质关联分析。聚类分析分离出三个主要组织簇，心脏与骨骼肌未聚集在一起，与心脏较高的脂蛋白脂肪酶水平一致。PGE2在所有组织（除软骨和血浆外）中均被鉴定，表明健康器官中存在持续PGE2合成以维持生理过程。模块分析独立验证了已知知识，并提出了多个新功能关联。特别重要的是，PUFAs与内质网和核糖体蛋白的关联提示PUFAs可能通过支持内质网伴侣功能来促进蛋白质合成保真度，这与传统观点（PUFAs与线粒体丰度相关）不同。低PUFAs和促消退介质水平的组织（软骨、肌肉、肌腱）可能固有地面临慢性炎症疾病（如骨关节炎、肌腱病）的风险。研究结论为：通过将蛋白质的已知功能知识投射到共现的生物活性脂质上，本研究鉴定出168种生物活性脂质（包括新表征的4-HETE），验证了该方法可独立确认已有知识，并发现了多种生物活性脂质参与特定生理过程的新关联，为理解这些重要分子的生理作用和潜在疾病意义提供了新视角。
