《Journal of Chromatography A》：Expanding Knowledge of the Volatilome in Novel Protein Sources by Coupling Thin-Film Solid-Phase Microextraction and Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography/Mass Spectrometry
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薄膜固相微萃取（TF-SPME）与全二维气相色谱/质谱（GC×GC/MS）联用技术为蛋白质来源提供了丰富的非靶向挥发性组学（volatilome）指纹图谱。单一的GC×GC工作流程即可为蛋白质挥发性组学提供有效的分离能力。潜在气味活性化合物的检出
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薄膜固相微萃取（TF-SPME）与全二维气相色谱/质谱（GC×GC/MS）联用技术为蛋白质来源提供了丰富的非靶向挥发性组学（volatilome）指纹图谱。单一的GC×GC工作流程即可为蛋白质挥发性组学提供有效的分离能力。潜在气味活性化合物的检出可区分不同蛋白质来源。在低样本量条件下即可获得信息量丰富的挥发性组学数据。
论文解读文章
一、研究背景与问题提出
食品基质的挥发性有机化合物组成一直是食品科学研究的重要议题，因为气味活性化合物在决定消费者对食品的感官感知方面发挥着核心作用。食品香气的产生源于多种生化途径生成的复杂挥发性有机化合物混合物，包括微生物代谢、脂质早期氧化、美拉德反应以及加工条件等。随着新型食品（包括替代蛋白质、昆虫基和植物基产品）的商业化进程加快，这一课题重新获得了关注。这些新型产品进入食品市场，必须满足全球人口增长带来的蛋白质丰富食品需求预期增长。
在新型蛋白质来源不断进入食品市场的同时，大量研究聚焦于表征其蛋白质含量以及挥发性有机组成。对于后者，多数研究依赖顶空固相微萃取（HS-SPME）方法，使用常规纤维作为萃取装置，并耦合气相色谱（GC）基方法。然而，传统一维气相色谱在处理复杂样品时面临严重挑战：薄膜萃取装置引入的大量分析物进入常规窄孔毛细管色谱柱后，会导致峰重叠，从而影响分析数据的可靠性。在非靶向分析中，这一问题尤为突出，因为共流出会显著降低分析物相对于参考质谱库的质谱相似度，阻碍峰鉴定。
为应对上述局限性，利用互补色谱柱选择性的优势，多维气相色谱方法长期以来被确立为实现更高峰容量的有效解决方案，从中心切割系统到全二维气相色谱（GC×GC）方法。GC×GC耦合质谱（MS）现已被广泛视为食品基质挥发性组学深度定性与定量表征的首选方法，因为它能有效避免一维方法典型的共流出问题。
尽管TF-SPME与GC×GC/MS联用具有明确潜力，但文献中关于该方法用于解析食品分析中挥发性组学复杂性的信息仍然稀缺。此外，考虑到新兴蛋白质来源在市场中的广泛分布，该方法可为其化学复杂性提供更深入的见解，补充蛋白质、脂肪和碳水化合物含量的信息。
二、研究内容与主要结论
基于上述背景，本研究旨在将薄膜装置的萃取能力与全二维气相色谱/质谱联用技术增强的峰容量相结合，对九种蛋白质来源的挥发性组学进行表征。具体而言，研究人员对牛肌肉、鱼蛋白、蛋粉、小麦面筋、黑水虻粉、菜籽粕粉、蟋蟀粉、黄粉虫粉和研磨海藻进行了顶空萃取，使用DVB/PDMS薄膜作为萃取装置，随后通过GC×GC/TOFMS分析进行详细基质表征。优化的GC×GC方法在全部九种样品中实现了增强的峰分离，最大程度减少了整个二维图谱中的峰重叠。这进而使得基于特定潜在气味活性化合物的存在，能够清晰区分传统与新型蛋白质来源，并通过主成分分析（PCA）进一步确认。
三、关键技术方法
研究人员采用DVB/PDMS薄膜固相微萃取（TF-SPME）作为顶空萃取技术，样品取自加拿大国家研究委员会提供的九种蛋白质标准参考物质（CRM），包括牛肌肉（BOVM-1）、鱼蛋白（DORM-5）、蛋粉（EGGS-1）、小麦面筋（GLUT-1）、菜籽粕粉（CAME-1）、研磨海藻（GSEA-1）、黑水虻粉（BFLY-1）、蟋蟀粉（KRIK-1）和黄粉虫粉（VORM-1）。萃取条件为400 rpm搅拌、50°C、90分钟，使用0.2 g固体样品与水按1:1比例混合。随后通过热脱附（TD）耦合全二维气相色谱/飞行时间质谱（GC×GC/TOFMS）进行分析，一维色谱柱为BPX5（非极性），二维色谱柱为BPX50（中等极性），调制周期优化为4.5秒以避免环绕现象。数据处理采用ChromCompare+软件，动态基线补偿（DBC）预处理，鉴定标准为质谱匹配因子>750且线性保留指数（LRI）偏差±20，参照NIST23数据库。主成分分析（PCA）使用100种最显著分析物的相对峰面积，在RStudio中采用stats、FactoMineR和factoextra包进行，数据经列自动缩放预处理。
四、研究结果
4.1 DVB/PDMS TF-SPME耦合GC×GC/TOFMS及多维分离的优势
由于薄膜萃取引入的大量分析物，单一分离准则无法充分表征目标基质，导致主成分与次成分之间的峰重叠。GC/MS色谱图证实了高样品复杂度导致一维非极性色谱剖面中大量共流出。为解决此问题，研究人员采用常规非极性（5%二苯基-聚二甲基硅氧烷）/中等极性（50%二苯基-聚二甲基硅氧烷）色谱柱组合进行GC×GC，实现正交分离。在优化色谱条件下，九种蛋白质来源中初步鉴定出超过500种分析物。以VORM-1样品为例，GC×GC/TOFMS允许初步鉴定155种分析物，而GC/MS仅鉴定45种，充分展示了多维分离在鉴定数量上的显著优势。GC×GC分析为黑水虻提取的挥发性有机化合物提供了有效分离能力，互补选择性色谱柱组合的优势在庚腈（峰184）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（峰187）、3-辛酮（峰188）、1-癸烯（峰195）、2-戊基呋喃（峰201）等组分的洗脱剖面中显而易见，这些组分在单一分离准则下会发生共流出。此外，该方法还防止了分析物与来自色谱柱涂层或吸附剂流失的硅氧烷相关信号之间的重叠。
4.2 九种蛋白质来源的挥发性有机组成
研究人员基于各化合物在样品间的分布及文献报道的气味阈值（空气/水），评估了各化合物的潜在香气相关性。表1总结了九种样品中鉴定出的潜在气味活性分析物，气味描述依据The Good Scents Company网站信息。
BOVM-1以二甲基二硫、三硫和四硫化物为主要含硫组分，这些代谢物可由半胱氨酸和蛋氨酸等氨基酸生成，是牛肉肉味的共同贡献者。BOVM-1还含有大量吡嗪类化合物，主要与烘烤和坚果香气相关。在m/z 135提取离子色谱图中，四种负责肉味的吡嗪在二维GC×GC剖面中成功分离。此外，通过早期自氧化生成的小链酯类与干酪和刺激性风味相关。
DORM-5（鱼蛋白）的挥发性剖面以甲硫醇（气味阈值0.0002 μg/L）、甲硫基丙醛（气味阈值0.0002 μg/L）和三甲胺（气味阈值0.000367 μg/L）等气味活性化合物为特征，共同产生明显的鱼腥味。苯甲醛和3,5-辛二烯-2-酮也被检出，这些化合物被描述为鱼类不良气味的潜在贡献者。
EGGS-1的挥发性组分与先前文献一致，1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃和己醛被确定为主要香气贡献者，赋予蘑菇型和青草型香气。GLUT-1样品中，2-戊基呋喃是最具代表性的杂环化合物，贡献甜味和焦糖样香气。
蟋蟀粉和黄粉虫粉均释放大量醛类、酮类、酯类和其他低分子量挥发性物质。两种样品中检出的吡嗪和含氧组分数量相当，而含硫分析物在蟋蟀粉中更为普遍，主要贡献硫磺和蔬菜样香气，如甲硫基丙醛、二甲基二硫和三硫化物以及2-噻吩甲醛。2-丁基-2-辛烯醛被鉴定为两种样品释放的主要挥发性物质之一，贡献甜味和金属气味描述，该化合物被描述为豌豆蛋白分离物中由醛醇缩合产生的异味物质，即使在极低浓度下也负责皂样气味。
BFLY-1的挥发性剖面表现出异常多样的化学组成，是所有样品中鉴定分析物数量最多的（>250种），蛋白质含量为54 g/100g。值得注意的是，该基质中鉴定出数量最多的吡嗪类化合物（20种），贡献坚果、巧克力、烘烤和烧焦气味。先前研究通过GC-O鉴定三甲胺和乙酸为黑水虻粉不良鱼腥味的主要挥发性分析物，但大多数与烘烤香气相关的组分因峰重叠问题无法匹配到可鉴定分析物。本研究中，通过GC×GC鉴定出的更多吡嗪类化合物可能有助于解释先前工作中报告的烘烤和烧焦气味，而3-甲基-N-(3-甲基亚丁基)-1-丁胺、2-丙酰基-1-吡咯啉和三甲胺被鉴定为鱼腥味和不良气味的可能贡献者。
CAME-1以数量最多的腈类化合物为特征，这些化合物通常由硫代葡萄糖苷降解生成，也赋予菜籽油独特风味。苯丙腈和5-(甲硫基)戊腈被鉴定为最具代表性的腈类，分别传递辛辣和硫磺/卷心菜感知。硫化物、噻吩和硫氰酸酯也在菜籽粕粉中持续检出，负责潜在的硫磺、芳香和刺激性气味。
GSEA-1表现出独特的挥发性剖面，以β-石竹烯、乙酸芳樟酯和α-葎草烯等萜烯类以及大量卤代化合物为特征。在所有研究样品中，仅研磨海藻释放碘代烷衍生化合物，如1-碘戊烷、1-碘己烷、1-碘庚烷和1-碘辛烷，这与海藻是生物系统中最强的碘积累者之一的文献一致。与所有其他样品相反，GSEA-1中未检出吡嗪类化合物，含硫类别中仅鉴定出二甲基三硫化物。3,5-辛二烯-2-酮和1-辛烯-3-醇（气味阈值0.0015 μg/L）也被检出为潜在气味活性组分。
4.3 样品区分的PCA分析
为更清晰地了解负责基质区分的潜在气味活性组分，研究人员使用100种最具代表性的变量进行主成分分析（PCA），变量根据气味描述、气味阈值（如有）及九种样品间的分布（峰面积>0.1%）进行选择。蛋白质来源根据鉴定出的潜在气味活性分析物的相对丰度分布。DORM-5和BFLY-1共享N,N-二甲基甲胺和苯甲醛作为主要气味活性分析物，均位于PCA图的右下象限。KRIK-1和VORM-1均位于得分图的左下象限，反映了两者共享2-丁基-2-辛烯醛、3-辛烯-2-酮、1-辛醇和甲酸庚酯等组分。腈类化合物如苄基腈和苯丙腈位于载荷图的右中象限，与CAME-1在该水平的位置一致。EGGS-1和GSEA-1共享1-辛烯-3-醇作为负责蘑菇样气味的主要分析物。GLUT-1因2-戊基呋喃的存在而位于图的左象限。总体而言，PCA被证明是区分样品的有效工具，其驱动力是在定义所研究蛋白质来源嗅觉特征中起关键作用的挥发性有机化合物。
五、结论
本研究将薄膜装置的高萃取能力与全二维气相色谱提供的高峰容量相结合，实现了对传统和新型蛋白质来源挥发性组学的深入表征。尽管所研究样品之间存在组成差异，但使用单一采用热调制的GC×GC方法为所有蛋白质来源提供了增强的分辨率。此外，TF-SPME与GC×GC/TOFMS的组合被证明是一种可持续且有效的挥发性组学分析途径，仅需少量样品（0.2 g）即可实现深入表征。
如PCA图所示，新型蛋白质来源中鉴定出特定的潜在气味活性组分，有助于与传统来源的明确区分。蟋蟀粉和黄粉虫粉表现出相似的挥发性剖面，以青草和甜味相关化合物为主要特征。值得注意的是，黑水虻粉与鱼蛋白共享若干潜在不良气味活性组分，以及贡献烘烤、坚果和肉味香气的吡嗪类化合物。TF-SPME与GC×GC的组合被证明是详细基质表征的有力方法，未来可通过耦合嗅觉检测法进一步增强，以深入理解各基质的具体气味贡献。
