《Journal of Chromatography Open》：Selectivity of Underivatized Mono- and Disaccharides on a Poly(4-vinylpyridine) Stationary Phase in Hydrophilic Interaction Chromatography: Influence of Reducing-Sugar Band Broadening on Resolution
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基于聚(4-乙烯基吡啶)的固定相(P4VP)可分离六种糖类。P4VP在添加乙酸铵后表现出微小的色谱变化。半乳糖/葡萄糖的分辨率更多地取决于峰展宽而非选择性。P4VP可能是碳水化合物分析的有用选择。
基于聚(4-乙烯基吡啶)的固定相(P4VP)可分离六种糖类。P4VP在添加乙酸铵后表现出微小的色谱变化。半乳糖/葡萄糖的分辨率更多地取决于峰展宽而非选择性。P4VP可能是碳水化合物分析的有用选择。
碳水化合物在食品、生物样品和药物中广泛存在，在能量代谢、细胞识别和生理功能调节中发挥重要作用。然而，天然碳水化合物缺乏发色团和荧光团，亲水性强，且含有大量结构相似的异构体，包括仅C4位构型不同的差向异构体。为获得足够的色谱保留并区分结构相关的糖类，通常需要衍生化处理，但衍生化增加分析复杂性并可能受反应效率和副产物影响。亲水相互作用色谱(HILIC)以乙腈/水流动相和极性固定相直接分析未衍生糖类，其中含伯氨基的固定相使用广泛，但伯氨基与还原糖之间可形成席夫碱，并存在峰形差和高温稳定性问题。聚(4-乙烯基吡啶)(P4VP)固定相含碱性吡啶基团但不含伯氨基，理论上不会与还原糖发生席夫碱反应，可能呈现不同于氨基柱的色谱行为。然而，P4VP对糖类的色谱选择性及其与现有固定相的关系尚未系统研究。
本研究旨在从实际应用角度全面表征DCpak P4VP在HILIC条件下对未衍生单糖和二糖的分离行为，并与已有的氨基、酰胺、两性离子等固定相进行比较，同时考察温度和流动相组成的影响。研究人员选取了食品中常见的六种糖：果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖，其中半乳糖与葡萄糖为C4位差向异构体，乳糖与麦芽糖为结构异构的二糖。通过比较异头物峰行为、差向异构体分离以及单糖/二糖相对保留，评估P4VP的分离特性。
关键技术方法上，本研究使用九种填充柱，包括商业化的DCpak P4VP、DCpak PTZ、DCpak PMPC、HILICpak VG-25、InertSil NH2、TSKgel Amide-80、Princeton SFC 4-Ethylpyridine，以及实验室制备的聚(2-乙烯基吡啶)(P2VP)和聚(1-乙烯基咪唑)(P1VI)柱。标准糖样品分别购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation和Nacalai Tesque。采用示差折光(RI)检测器，在1.0 mL/min流速下进行等度洗脱。为在相似保留水平下比较各柱，独立调节乙腈/水比例使最后洗脱糖保留时间为15–19分钟。研究考察了温度(20–60°C)、乙酸铵浓度(0–100 mM，以水相组分计)、水相pH(3.00–9.00)以及三氟乙酸(TFA)添加的影响，并计算保留因子(k)、表观选择性因子(α)、分辨率(Rs)和半高峰宽(w
0.5)。为量化还原糖相对蔗糖的额外展宽，提出了基于5–95%累积面积区间的辅助参数αQ。
3.1 六种单糖和二糖在不同色谱柱上的色谱行为：在九种柱上比较了六种糖的分离。P4VP的洗脱顺序为果糖(1) < 半乳糖(2) < 葡萄糖(3) < 蔗糖(4) < 乳糖(5) < 麦芽糖(6)，与叔胺固定相相似。伯胺固定相的顺序为果糖(1) < 葡萄糖(3) < 半乳糖(2) < 蔗糖(4) < 麦芽糖(6) < 乳糖(5)，即半乳糖和葡萄糖顺序颠倒。酰胺柱和PMPC柱对某些糖表现出异头物峰分裂；PTZ柱无峰分裂，但半乳糖(2)/葡萄糖(3)分离不足，且乳糖(5)/麦芽糖(6)洗脱顺序与P4VP相反。4-EP柱需要极高有机相比例(98/2)但未完全分离六种糖；P2VP和P1VI柱的洗脱顺序与P4VP一致。这些结果表明，P4VP的糖类选择性不同于伯胺柱，更接近叔胺柱和碱性含氮杂环聚合物固定相。
3.2 结构相似糖对的选择性与分辨率：将P4VP与叔胺柱进行详细比较。对于半乳糖(2)/葡萄糖(3)对，P4VP的α为1.16，Rs为1.62；叔胺柱的α为1.08，Rs为1.55。对于乳糖(5)/麦芽糖(6)对，P4VP的α为1.20，Rs为2.68；叔胺柱的α为1.10，Rs为2.59。尽管P4VP的α明显更大，但Rs差异很小，表明还原糖峰展宽限制了实际分辨率。这一观察促使后续温度研究。
3.3 温度对半乳糖(2)/葡萄糖(3)对选择性和峰形的影响：以葡萄糖为代表考察了温度对还原糖峰形的影响。在20°C下，P4VP上葡萄糖出现分离的异头物峰，随温度升高逐渐合并；叔胺柱在20°C部分分离，40°C以上合并；伯胺柱即使在20°C也呈现合并峰。异头物分离可观察性顺序为P4VP > 叔胺柱 > 伯胺柱。伯胺柱在60°C下葡萄糖峰面积较30°C下降约42%，而蔗糖峰面积几乎不变，提示还原糖与伯胺基发生反应。P4VP在60°C下连续300次进样后，保留因子和Rs保持稳定。在40–60°C范围内，P4VP上半乳糖/葡萄糖的α几乎恒定(1.16–1.18)，但Rs从1.62降至0.85，同时半高峰宽总和从0.48分钟增至1.58分钟。对照蔗糖的柱效几乎不变，而还原糖表观柱效显著下降，说明还原糖存在与变旋相关的额外展宽。辅助参数αQ一致地描述了从分离到合并峰形的额外展宽。
3.4 乙酸铵及水相pH的影响：在P4VP和叔胺柱上考察了乙酸铵浓度的影响。对于P4VP，当乙酸铵浓度（以水相组分计）从0增加到100 mM时，葡萄糖的保留因子仅从2.58增至2.75，半高峰宽从0.26分钟增至0.32分钟；而叔胺柱上葡萄糖的k从2.33增至2.84，峰宽从0.15分钟增至0.27分钟。P4VP对乙酸铵的响应明显较小。将水相pH从3.00调至9.00，P4VP上所有糖的保留因子基本不变；但加入0.1% TFA后，保留显著增加且异构体分离消失。这些结果表明，P4VP的糖类分离对乙酸铵浓度不敏感，有利于从无盐方法转换到LC-MS兼容的含挥发性盐条件。
3.5 P4VP的峰面积响应与峰形特征：在0.05–2.0 g/L范围内，峰面积与进样质量近似线性相关，R2为0.9975–0.9984。重复性随进样量增加而改善，进样量≥10 μg时所有糖的峰面积RSD≤3.4%。但进样量较低时，葡萄糖峰宽增大，半乳糖/葡萄糖分辨率下降，蔗糖峰宽也增大，说明低样品量下的展宽并非还原糖特有。由于RI检测灵敏度限制，未能在更低样品量下进行测量。
讨论与结论：P4VP对六种糖的洗脱顺序与叔胺柱类似，但对温度和乙酸铵的响应不同。温度降低时，半乳糖/葡萄糖的α几乎不变而Rs下降，主要归因于还原糖变旋导致的峰展宽。乙酸铵添加对P4VP影响较小，pH变化几乎无影响，而TFA引起显著变化。P4VP需要较高温度抑制异头物分离，但该温度超出产品说明书规定的0–40°C范围，因此结果仅适用于本研究的色谱条件。由于使用RI检测，表观柱效和峰形受样品量影响，低样品量时峰变宽。未来可采用更灵敏的检测器（如MS或CAD）在更低样品量下研究，并评估UHPLC和流速依赖性条件下的长期耐用性。总体而言，P4VP可作为碳水化合物分析的替代固定相，其色谱行为不同于已建立的HILIC固定相，尤其适合需要挥发性添加剂的LC-MS条件。
