《Advanced Science》：Genome-Wide and Multi-Omics Analysis Identified DNA-Interacting Circular RNA circFOXK2 as MLL1 Regulator for Histone H3K4 Methylation in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
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胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是致死率极高的恶性肿瘤之一，尽管现有治疗手段不断进步，其预后仍然很差。环状RNA（circular RNAs, circRNAs）在众多生物学过程及疾病发生发展中发挥重
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是致死率极高的恶性肿瘤之一，尽管现有治疗手段不断进步，其预后仍然很差。环状RNA（circular RNAs, circRNAs）在众多生物学过程及疾病发生发展中发挥重要作用，但其潜在机制仍远未被阐明。为寻找新的可成药靶点，本研究旨在阐明circRNAs在PDAC中关键作用的相关机制。研究人员针对circFOXK2-DNA互作在PDAC进展中的作用开展了全基因组及多组学研究。基于公共数据集的单细胞ATAC测序（single-cell ATAC-sequencing）分析揭示了circFOXK2-DNA互作网络在肿瘤内异质性中的重要性。通过互补碱基配对介导的circRNA-DNA互作，circFOXK2可识别位于不同基因组位置的靶标：增强子、启动子及基因内区域。circFOXK2通过分子内碱基配对形成对接口袋，容纳肽基脯氨酰异构酶E（peptidylprolyl isomerase E, PPIE）的N端RNA识别基序（RNA-recognition motif, RRM），从而破坏PPIE-MLL1互作。此举解除了PPIE对混合谱系白血病1（mixed lineage leukemia 1, MLL1）的抑制作用，促进具有基因激活作用的H3K4甲基化。具体而言，circFOXK2通过增强启动子区H3K4me3促进TMSB15B与BCAS1表达；在基因体区域，circFOXK2通过基因内H3K4me3促进TRIO与LAMA4的转录延伸；在远端基因间增强子区，circFOXK2通过促进CYP26A1与TCP11的H3K4me1实现基因激活。上述结果凸显了circRNA-DNA互作在基因调控中的重要性及治疗潜力。
胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第四大原因，总体生存率仅13%，现有治疗手段有限且致死率极高，亟需探索新的分子机制以发现可成药靶点。环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，既往研究多聚焦于其作为microRNA（miRNA）海绵的功能，但许多circRNA丰度远低于miRNA且仅含少量miRNA结合位点，提示miRNA海绵可能并非其主要调控机制；同时，circRNA通过蛋白互作、RNA结合及DNA结合参与表观遗传调控的新机制不断被揭示，但其在PDAC中的详细功能与调控机制仍 largely 未被阐明。研究人员此前已证实PDAC肿瘤中上调的circFOXK2可促进肿瘤生长与肝转移，本研究在此基础上进一步探究其致癌作用的详细分子机制。研究基于前期发现，采用全基因组、多组学、单细胞、功能及临床研究相结合的策略，揭示circFOXK2通过circRNA-DNA互作在表观遗传与基因表达调控中的新机制：circFOXK2通过互补碱基配对识别位于增强子、启动子及基因内区域的下游靶基因；在靶基因处，circFOXK2通过分子内碱基配对形成对接口袋，结合PPIE的N端RRM，破坏PPIE-MLL1互作，解除PPIE对MLL1的抑制，从而促进基因激活性的组蛋白H3赖氨酸4甲基化（H3K4me）。研究结论表明，circFOXK2通过序列特异性circRNA-DNA互作在不同基因组位置激活MLL1，促进增强子区H3K4me1、启动子区H3K4me3以实现基因激活，并在基因内区域通过H3K4me3促进转录延伸，进而推动PDAC生长与转移。该研究揭示了circRNA在基因调控中的功能与机制重要性，并为靶向circRNA-DNA互作治疗PDAC等疾病提供了新的治疗方向，论文发表于《Advanced Science》。
在技术方法上，研究人员主要采用：①染色质分离RNA纯化测序（ChIRP-seq）联合RNA测序（RNA-seq）进行全基因组circFOXK2-DNA互作与差异基因鉴定；②基于公共数据集的单细胞ATAC测序（scATAC-seq）分析肿瘤内异质性；③RNA免疫沉淀（RIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、免疫共沉淀（Co-IP）及三维（3D）计算建模（3dRNA、RBPmap、HDOCK）验证circFOXK2-PPIE互作与结构；④染色质免疫沉淀（ChIP）、DNase I核可及性实验及核连缀转录（nuclear run-on）实验评估H3K4me、染色质开放性与转录延伸；⑤功能实验（MTS、克隆形成、迁移、侵袭）及临床样本分析，其中临床样本为香港威尔士亲王医院接受胰腺切除患者的84对PDAC原发肿瘤与癌旁非肿瘤组织。
研究结果如下：（1）circFOXK2-DNA互作的全基因组鉴定：临床相关性分析显示男性PDAC患者circFOXK2水平升高，其上调与分化程度正相关；敲低circFOXK2可增强PDAC细胞对吉西他滨的敏感性。RNA-seq鉴定出1408个circFOXK2调控基因，ChIRP-seq鉴定出7400个circFOXK2互作基因，二者重叠得到300个受circRNA-DNA直接互作调控的基因；互作峰主要位于基因间区（50.2%）、基因体（45.1%）与启动子（3.7%），并含保守结合基序，提示其基因调控具有高度序列特异性。（2）circFOXK2通过序列特异性circRNA-DNA互作激活PDAC相关基因表达：ChIRP实验证实circFOXK2结合TRIO、LAMA4、BCAS1、TMSB15B、CYP26A1与TCP11，敲低circFOXK2降低其结合并下调表达，小鼠移植瘤中结果一致；TCGA及自建队列中上述靶基因在PDAC中上调且与circFOXK2表达正相关，TRIO与LAMA4上调与不良预后相关；敲低靶基因可抑制癌细胞生长、迁移与侵袭，并可挽救circFOXK2的致癌能力。（3）PDAC细胞单细胞ATAC测序揭示circFOXK2调控基因转录的作用：基于PANC-1公共数据集获得6070个细胞、115 030个特征，UMAP划分出5个亚群；拟时序分析显示低转录活性的cluster 2为早期状态，而cluster 0与3为晚期状态；晚期细胞具7070个差异可及性峰（来自6318个基因），富集于胰腺癌、细胞生长与迁移通路，早期细胞则富集Ras信号、干细胞分裂与维持；circFOXK2基因活性在表观遗传与转录活性增强的cluster 3中升高，与Kras、迁移相关基因及抗凋亡基因活性正相关，cluster 0与3转移能力增强且下游靶基因活性升高；MYC与FOS结合于circFOXK2启动子，MYC基因活性与circFOXK2正相关，提示MYC潜在调控circFOXK2。（4）circFOXK2与MLL抑制因子PPIE互作：质谱分析显示circFOXK2互作蛋白富集于表观遗传、染色质结构与基因转录；RIP与EMSA证实circFOXK2-PPIE互作；3D建模显示circFOXK2通过分子内互补配对形成多个螺旋结构及对接口袋，其残基283与307处的两个AU富集基序（AAUAAUAA）经TYR9、ARG47、PHE49、PRO38与ASP40结合PPIE的RRM；突变该基序可抑制互作；敲低circFOXK2后PPIE与MLL1结合增加，小鼠移植瘤中PPIE-MLL1共定位增加，突变PPIE结合基序亦促进PPIE-MLL1互作。（5）circFOXK2隔离PPIE以促进H3K4甲基化与基因转录：敲低circFOXK2后PDAC细胞与小鼠移植瘤中总H3K4me1与H3K4me3水平下降，而PPIE表达不变；突变PPIE结合基序或敲低MLL1可挽救circFOXK2在HPDE细胞中的致癌能力；PDAC肿瘤中circFOXK2上调者PPIE-MLL1共定位减少，H3K4me3水平与circFOXK2正相关、与PPIE-MLL1互作负相关；circFOXK2互作基因与MLL1表达及H3K4me3水平正相关，并与染色质可及性及RNA聚合酶II（RNA PolII）结合增加正相关。（6）circFOXK2通过基因内H3K4me3促进转录延伸：TRIO与LAMA4基因上H3K4me3水平与染色质可及性升高；敲低MLL1降低H3K4me3、染色质可及性及TRIO、LAMA4表达，敲低PPIE则相反；敲低circFOXK2增加PPIE结合、降低MLL1结合与H3K4me3水平，抑制染色质可及性及RNA PolII与磷酸化丝氨酸2（RNA PolII Ser2）水平，核连缀实验证实转录延伸效率下降。（7）circFOXK2结合启动子与增强子促进基因激活型H3K4me：PDAC中TMSB15B与BCAS1启动子H3K4me3升高；敲低MLL1降低其启动子H3K4me3并下调表达，敲低PPIE则上调表达；敲低circFOXK2降低MLL1结合与H3K4me3水平及基因表达。PDAC中CYP26A1与TCP11增强子H3K4me1升高；敲低MLL1降低增强子H3K4me1并抑制表达，敲低PPIE促进表达；敲低circFOXK2降低增强子处MLL1结合与H3K4me1，导致CYP26A1与TCP11下调。
讨论部分：circRNA以共价闭合环状结构为特征，miRNA海绵是其最早发现的机制，但越来越多研究表明circRNA可通过蛋白互作、RNA与DNA结合参与表观遗传调控。长链非编码RNA（lncRNA）HOTTIP作为支架招募MLL/WDR5复合物至基因启动子激活H3K4me3，lncRNA ecCEBPA隔离DNA甲基转移酶DNMT1以实现基因低甲基化与转录激活；类似地，circFECR1招募DNA去甲基化酶TET1至FLI1启动子，circEIF3J与circPAIP2在启动子及第一外显子与U1 snRNA及RNA PolII互作促进转录起始，circANKRD52与磷酸化Ser2 RNA PolII互作增强转录延伸，提示circRNA的详细机制仍待深入探索。本研究中，男性、分化型PDAC患者circFOXK2表达进一步升高；除PDAC外，circFOXK2在乳腺癌、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌及肝细胞癌中亦上调并促进癌症进展，提示靶向circFOXK2具有跨癌种治疗方向。研究人员通过全基因组、多组学与单细胞研究揭示circFOXK2经circRNA-DNA互作调控基因的新机制，ChIRP-seq与转录组分析揭示其在不同基因组位置的关键作用，质谱鉴定出参与基因转录与表观遗传的互作蛋白，并重点聚焦circFOXK2-PPIE互作。MLL1是著名的表观遗传修饰因子，通过SET结构域与PHD3结构域催化启动子H3K4me；除启动子外，MLL1在其他基因组位置亦重要：基因间区富集的H3K4me1标记活跃增强子，促进染色质重塑与RNA PolII结合；启动子与第一外显子的宽H3K4me3峰通过促进RNA PolII从转录起始位点暂停释放而支持高效转录；基因内H3K4me3可通过形成真染色质结构促进转录延伸与基因表达。MLL1的这些调控作用受抑制因子PPIE高度调控，其PPIase结构域使MLL1异构化，促进PPIE的RRM与MLL1的PHD3互作，破坏MLL1的PHD3-bromo界面并抑制H3K4me。MLL2-4虽具高度相似的PHD3结构域，但MLL2 PHD3不与PPIE互作，仅含独特Met1606残基的MLL1受PPIE调控；该PPIE-MLL1互作被认为由RNA介导，RNA结合PPIE的RRM诱导构象变化以促进MLL1互作，其他AU富集RNA亦可与PPIE互作解除MLL1抑制效应，但确切的隔离RNA仍未知。本研究发现circFOXK2含AU富集PPIE结合基序，形成区域性对接口袋容纳PPIE的RRM；circFOXK2通过互补碱基配对形成DNA-DNA-RNA三链结构以在不同基因组位置识别靶基因，在靶基因处circFOXK2-PPIE互作使PPIE从MLL1上置换，恢复MLL1正常构象以促进基因激活型H3K4甲基化并增强基因转录。PDAC肿瘤内异质性对癌症发生发展至关重要，癌细胞系的单细胞转录组亦存在异质性，可分为亚群空间离散的离散型与亚群间无明显边界的连续型，其临床相关异质性决定干性、侵袭性、转移与治疗反应。本研究中PANC-1细胞scATAC-seq显示PDAC细胞呈连续亚群，circFOXK2基因活性上调的亚群与表观遗传及转录活性增强的分化状态相关，并具更强的增殖与转移能力，与此前circFOXK2促进PDAC生长与肝转移的发现一致；分化状态亚群中circFOXK2调控靶基因活性升高，单细胞水平circFOXK2基因活性与下游靶基因表达正相关，提示circFOXK2调控通路参与PDAC异质性；上调的circFOXK2促进TRIO、LAMA4、TMSB15B、BCAS1、CYP26B1与TCP11失调，其中TRIO上调促进癌细胞迁移与侵袭，LAMA4作为细胞黏附与迁移相关的细胞外糖蛋白在PDAC中显著上调并促进肝转移，TMSB15B上调促进癌细胞迁移，CYP26A1上调促进癌细胞生长与侵袭；此外，研究鉴定MYC为潜在调控circFOXK2表达的转录因子，单细胞水平circFOXK2与MYC基因活性正相关，ChIP-seq显示MYC结合circFOXK2启动子。综上，MYC上调的circFOXK2通过circRNA-DNA互作经H3K4甲基化激活致癌基因表达。
研究结论（翻译）：circFOXK2在增强子、启动子及基因内区域的表观遗传调控中发挥重要作用。机制上，circFOXK2通过序列互补与下游基因互作，形成DNA-DNA-RNA三链结构；在靶位点，circFOXK2通过其AU富集基序与独特对接口袋与PPIE互作，解除MLL1的抑制效应，从而促进基因激活型H3K4甲基化。研究结果揭示了circRNA在基因调控中的功能与机制重要性的新见解，并发现了靶向circRNA-DNA互作治疗PDAC及其他疾病的新治疗方向。
