无间隙完整基因组与多组学联合揭示中华菊头蝠的免疫适应与宿主-病毒互作机制

《Advanced Science》：Gapless Complete Genome and Multi-Omics Illuminate Immune Adaptation and Host-Virus Interactions in a Coronavirus Reservoir

　　

蝙蝠是包括严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）相关冠状病毒在内的重要新发病毒储存宿主，然而其对病毒感染表现出显著的耐受性，仅出现有限的临床表型的特征，这构成一个长期存在的免疫学悖论。本研究为中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus，R. sinicus）生成了端粒到端粒（telomere-to-telomere，T2T）从头（de novo）基因组组装，命名为T2T-RSC1.0（2.14 Gb），包含17条完整锚定的常染色体及两条性染色体。该无缺口组装解析了129.19 Mb的先前未解析区域（previously unresolved regions，PURs），并实现了848个先前未注释基因的注释，其中包括位于33.75 Mb Y染色体上的131个蛋白编码基因与5个假基因。利用PURs内新鉴定的2.12 × 10⁵个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs），群体基因组分析解析出三个主要遗传群，并以更高分辨率刻画了全基因组群体结构。比较分析进一步揭示群体水平上主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）多态性与病毒多样性之间的关联。多组学与功能分析揭示菊头蝠中抗病毒防御、抗原呈递、细胞因子信号与炎症调控的协同进化重塑。本研究为R. sinicus提供了前所未有的基因组资源，并为探究免疫进化、长期宿主-病毒共存及哺乳动物适应进化建立了整合性框架。

**研究背景与意义**

蝙蝠（Chiroptera，翼手目）是哺乳动物中唯一具备动力飞行的类群，集回声定位、卓越寿命与独特免疫于一身，是冠状病毒、丝状病毒（filovirus）与副黏病毒（paramyxovirus）等多种新发病毒的天然储存宿主，但感染后通常不表现明显临床症状，构成一个长期存在的"免疫耐受悖论"。现有蝙蝠基因组组装在重复序列、着丝粒、节段重复（segmental duplication，SD）与复杂免疫基因簇区域仍残留未解析缺口，限制了结构变异与免疫相关位点的全面解析。中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）是东亚特有、遗传多样性丰富的SARS相关冠状病毒天然储存宿主，并被推荐为蝙蝠实验研究的代表性物种，但其现有染色体级组装仍不完整。为此，研究人员构建了无缺口完整基因组并整合多组学数据，该论文发表于《Advanced Science》，为解析免疫进化、宿主-病毒长期共存与哺乳动物适应进化提供了重要框架。

**主要研究内容与结论**

研究人员以一只来自中国江西省的成年中华菊头蝠为参考个体，生成端粒到端粒（telomere-to-telomere，T2T，指从染色体一端端粒连续组装至另一端端粒的无缺口组装）基因组T2T-RSC1.0（2.14 Gb），整合群体基因组学、比较基因组学、单细胞转录组学、表观基因组学、宏病毒组学与体外免疫刺激实验，系统解析了菊头蝠的免疫适应与宿主-病毒互作，得出免疫适应体现为抗病毒防御与炎症调控协同进化重塑的核心结论。

**关键技术与样本队列**

研究人员综合运用PacBio HiFi（121.2 Gb，约56×覆盖度）、Oxford Nanopore超长相ONT（UL-ONT，247.1 Gb，115×）、Hi-C染色质构象数据（217.1 Gb）、Bionano光学图谱（1.21 Tb）及MGISEQ短读数据（126 Gb），以hifiasm完成HiFi与UL-ONT混合组装并经Hi-C挂载，经Bionano验证、缺口延伸与端粒补全获得T2T-RSC1.0；以来自中国8个地理群体的52只中华菊头蝠进行全基因组重测序，开展群体基因组与选择分析；整合Iso-seq全长转录组、RNA-seq、ATAC-seq与CUT&Tag表观组学构建脾脏单细胞转录组图谱；采集各群体肠道组织进行病毒宏基因组测序；并体外以脂多糖（LPS）与聚肌胞苷酸poly(I:C）刺激脾细胞验证免疫应答。

**主要结果**

2.1 中华菊头蝠完整无缺口基因组组装：混合组装经Hi-C数据挂载为19条假染色体（17条常染色体加X、Y），结合UL-ONT读段延伸与局部重组装填补全部缺口，最终组装包含17条常染色体及X（117.03 Mb）、Y（33.75 Mb）两条性染色体，含38个端粒与19个着丝粒，各测序平台读段比对率为99.48%至99.97%，碱基准确率超过99.999%。

2.2 较既往参考基因组的连续性提升：与RSC01相比，contig N50提升3.37倍至187.51 Mb，解析129.19 Mb PURs（重复序列富集度43.2%至88.7%），SD占基因组比例由3.62%升至17.29%，共校正170处倒位错误，BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs，通用单拷贝直系同源基因评估）完整度98.6%高于RSC01的96.4%。

2.3 变异检测与群体基因组推断：52只个体共鉴定7.02 × 10⁶个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP），其中2.12 × 10⁵个位于PURs；群体结构分析解析出东南（SE）、中西（MW）、西南（SW）三个遗传群，SW与SE间加权F_ST最高（0.59），SE与MW为0.44，SW与MW为0.54；PSMC（成对序贯马尔可夫溯祖分析）显示三群在末次冰盛期（Last Glacial Maximum，LGM）均经历种群瓶颈且历史动态在冰期事件后发生分化。

2.4 Y染色体架构与进化动态：Y染色体79.19%为重复序列，长散在元件（LINEs）占60.84%，注释131个蛋白编码基因与5个假基因，未发现X转座区（X-transposed regions）；X与Y序列比对鉴定出四个由老到新的进化层（evolutionary strata）；CLDN34基因家族在Y染色体扩增至52份拷贝且睾丸特异表达，X染色体仅保留单拷贝（X-Y间ω为2.60943）；ZFY、DDX3Y、USP9Y与UTY等雄性决定与精子发生关键基因位于退化的X同源区（X-degenerate regions）。

2.5 改进基因注释揭示性状相关特征：共注释20,328个蛋白编码基因（99.2%完整保守直系同源基因）；新鉴定848个位于PURs的基因，其中20个与免疫或抗病毒功能相关；发现此前被认为在蝙蝠中丢失的α-防御素DEFA5基因具有完整开放阅读框并在胃与脾表达；TEAD4、TULP3、RHNO1与FOXM1串联阵列构成协同抗衰老调控模块；KNG1与HRG在肝脏形成参与止血与伤口愈合的串联阵列。

2.6 宿主MHC多样性与病毒多样性的群体关联：依托无缺口基因组与全长转录组完整组装3.53 Mb MHC簇，MHC-A拷贝数扩张且I类基因区较近缘种大2.6倍；SW群MHC区核苷酸多样性（π）与SNP数量最高，病毒α多样性（Shannon指数）显著高于SE群（P < 0.01），提示宿主免疫基因组变异与病毒群落结构存在群体水平关联。

2.7 比较基因组学揭示进化性免疫适应：基于15个哺乳动物基因组鉴定9,709个单拷贝直系同源基因，系统发育树各节点bootstrap支持率为100%；R. sinicus有18个显著收缩与146个显著扩张基因家族；1,119个假基因显著富集于NLRP3炎症小体负调控等通路，促炎因子IL-36A在全部受检菊头蝠中假基因化；鉴定85个正选择基因（positively selected gene，PSG）与16个快速进化基因（rapidly evolving gene，REG），菊头蝠属水平为236个PSG与21个REG，涉及NLRC5、PRF1、TRIM21、SAMHD1、LRRC25、IL18RAP、IL10RA等抗病毒与免疫调控基因。

2.8 脾脏细胞图谱与免疫刺激分析：单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）获得26,102个脾脏细胞并注释14种主要免疫细胞类型；菊头蝠固有免疫细胞（巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞）比例高于人与小鼠；LPS刺激下蝙蝠呈现减弱的炎症转录特征，poly(I:C）刺激下激活TLR7信号、粒细胞反应与IFN-α产生，提示干扰素相关抗病毒应答与炎症反应的物种特异性差异调控。

**讨论与结论**

讨论部分指出，无需家系或亲本数据的单一个体无缺口组装策略为非模式生物提供了可推广的参考框架；Y染色体的完整解析揭示了翼手目性染色体四个进化层的分化模式；群体水平上MHC多态性与病毒多样性的关联与长期宿主-病毒互作（包括潜在共进化）塑造免疫基因组多样性的观点一致；菊头蝠的免疫适应体现为抗病毒防御与炎症调控的协同重塑，而非免疫通路的广泛激活。作者同时指出局限：样本量有限，免疫适应与病毒耐受相关结论主要基于比较基因组学、转录组与体外实验，因果机制尚未确立，跨平台细胞比例比较亦需谨慎解读，未来需体内感染模型与功能验证。研究结论部分（译文）：本研究为菊头蝠R. sinicus——SARS相关冠状病毒的关键天然储存宿主——提供了完整的T2T基因组，该资源使解码蝙蝠特异性免疫应答、适应进化与宿主-病毒互作的基因组与细胞蓝图成为可能，为自然储存宿主在长期与多种病毒互作过程中维持免疫稳态提供了进化层面的见解，并对人类感染管理与免疫病理防控具有转化意义。