内质网自噬增强通过缓解STING介导的PKM2活性抑制改善SAE小鼠突触可塑性功能障碍与认知损伤

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Endoplasmic Reticulum Autophagy Enhancement Alleviates Synaptic Plasticity Dysfunction and Ameliorates Cognitive Impairment in SAE Mice by Relieving STING-Associated Inhibition of PKM2 Activity

　　

背景：脓毒症相关性脑病（SAE）患者认知损伤的发病机制尚不明确。本研究探讨了增强微内质网自噬能否通过缓解干扰素基因刺激因子（STING）相关的丙酮酸激酶M2（PKM2）活性抑制，从而减轻SAE小鼠模型的突触功能障碍并改善其认知损伤。 方法：研究人员使用了雄性野生型和神经元特异性PKM2条件性敲除小鼠（PKM2fl/fl; hSyn-Cre+）。采用Y迷宫实验和环境恐惧条件反射测试评估SAE小鼠模型的认知功能。利用透射电子显微镜和高尔基染色检测神经元可塑性，同时运用免疫荧光染色和蛋白质印迹法确定相关蛋白的时空表达模式。 结果：脓毒症小鼠出现了认知损伤。SAE小鼠的海马组织表现出突触可塑性功能障碍和糖酵解增强。与此同时，海马区PKM2表达增加，PKM2四聚体与二聚体的比例发生改变。此外，磷酸化STING在海马神经元中的浓度显著升高，敲低STING可改善其认知功能。然而，这种认知功能的挽救在经SAE处理的PKM2条件性敲除小鼠中未能实现。最终，Sec62介导的微内质网自噬促进了STING的溶酶体降解，这缓解了STING介导的对PKM2的抑制，并改善了SAE小鼠的突触可塑性和认知功能障碍。 结论：增强微内质网自噬可能缓解STANG相关的PKM2活性抑制，改善神经元糖酵解和突触可塑性，并减轻SAE小鼠的认知功能障碍。

论文解读：内质网自噬增强通过缓解STING介导的PKM2活性抑制改善SAE小鼠突触可塑性功能障碍与认知损伤

1. 研究背景与研究目的

脓毒症相关性脑病（SAE）是由脓毒症引发的弥漫性脑功能障碍，约20%的幸存者会遭受持续的认知损伤，但其具体发病机制尚不清楚。现有研究表明，SAE的病理机制可能与神经炎症反应、突触功能障碍和细胞死亡有关。突触可塑性对代谢不足高度敏感，而糖酵解酶丙酮酸激酶M2（PKM2）在应激条件下驱动神经元的能量代谢，其在活性四聚体和低活性二聚体之间动态转换。然而，在SAE小鼠海马组织中调控PKM2表达的精确机制仍不明确。干扰素基因刺激因子（STING）可调节细胞能量代谢和炎症反应，并在肿瘤细胞中抑制糖酵解介导的ATP产生。研究人员前期工作表明，下调STING可减轻海马神经元损伤并挽救SAE小鼠的认知障碍，但STING是否通过调控PKM2影响SAE小鼠突触可塑性相关的能量代谢仍需进一步探究。此外，微内质网自噬是一种通过溶酶体膜内陷直接吞噬受损内质网成分以维持细胞稳态的过程，SEC62在其中发挥关键作用，且SEC62与STING共享相同的LC3相互作用区域（LIR）结构域，但微内质网自噬是否参与调控SAE进展中的STING尚不清楚。因此，本研究旨在阐明增强微内质网自噬是否能通过缓解STING介导的PKM2活性抑制，进而改善SAE小鼠的突触可塑性和认知功能障碍。

2. 主要技术方法

研究人员建立了雄性C57BL/6J小鼠的盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型，并使用了从空军军医大学获得的神经元特异性PKM2条件性敲除（PKM2 cKO）小鼠及其对照小鼠。通过立体定位注射技术，向小鼠海马CA1区微量注射多种重组腺相关病毒（rAAV）载体以实现基因敲低或过表达，包括STING-shRNA、对照shRNA（scRNA）、小胶质细胞特异性STING-shRNA（hIBA1a-STING-shRNA）、Sec62过表达病毒（AAV-hSyn-Sec62）及其对照病毒。通过侧脑室注射PKM2激活剂DASA-58进行药物干预。行为学评估采用了旷场实验（OFT）、环境恐惧条件反射测试（CFCT）和Y迷宫实验。形态学方面，利用尼氏染色观察神经元存活，高尔基染色评估树突棘密度，透射电子显微镜（TEM）定量分析突触超微结构和溶酶体。分子生物学方面，通过蛋白质印迹法（WB）检测目标蛋白表达水平及PKM2四聚体/二聚体比率，利用免疫荧光（IF）染色观察蛋白的细胞定位与共定位。此外，还进行了原代海马神经元（PHNs）培养、放线菌酮（CHX）追踪实验以评估蛋白稳定性，以及ATP/ADP比值和NAD⁺/NADH比值的测定以反映糖酵解能量代谢状态。

3. 研究结果

3.1 SAE改变糖酵解、突触可塑性和行为学损伤

研究发现，CLP术后14天生存率为50%。行为学测试显示SAE小鼠出现认知功能障碍。SAE小鼠海马CA1区尼氏小体数量在第7天和第14天显著减少，第14天突触可塑性明显受损。在CLP诱导脓毒症后第1天，小鼠海马葡萄糖浓度、ATP/ADP和NAD⁺/NADH比值均显著下降，同时突触蛋白synapsin 1和PSD95的表达也显著降低。

3.2 增强PKM2活性改善SAE小鼠的糖酵解、突触可塑性和行为学损伤

SAE小鼠海马组织中PKM2表达及其四聚体/二聚体比率在第1天和第2天显著升高。使用PKM2激动剂DASA-58后，虽然各组小鼠运动功能无差异，但DASA-58显著改善了SAE小鼠的认知缺陷和海马CA1区的突触可塑性。到第7天，治疗组小鼠海马的ATP/ADP比值、NAD⁺/NADH比值、PKM2总量、PKM2四聚体/二聚体比率以及synapsin 1和PSD95的表达均显著高于对照组。

3.3 p-STING在SAE小鼠海马组织中的表达增加

定量WB分析显示，CLP术后第1天和第2天，海马中p-STING/STING蛋白的表达水平显著升高。IF染色结果表明，在SAE小鼠海马CA1区，p-STING与神经元广泛共定位，同时也与小胶质细胞标志物Iba1存在强共定位，表明在SAE进展过程中，神经元和小胶质细胞中的STING均被过度激活。

3.4 敲低STING通过增强PKM2活性改善SAE小鼠的行为学和突触可塑性损伤

通过在海马CA1区注射STING-shRNA敲低STING表达后，SAE小鼠的认知功能得到显著改善。在第7天，SAE+STING-shRNA小鼠的海马组织显示出突触可塑性（synapsin 1和PSD95表达）上调，以及糖酵解的增强，包括更高的ATP/ADP比值、NAD⁺/NADH比值、总PKM2水平和PKM2四聚体/二聚体比率。电生理记录表明，下调STING表达逆转了CLP诱导的海马CA1区神经元兴奋性增高和长时程增强（LTP）缺陷，并恢复了微小兴奋性突触后电流（mEPSC）的频率。此外，小胶质细胞特异性敲低STING同样改善了SAE小鼠的认知障碍。

3.5 下调STING不能改善PKM2 cKO SAE小鼠的行为学损伤

PKM2 cKO小鼠与其对照同窝小鼠相比表现出显著的认知障碍。将STING敲低病毒注射入PKM2 cKO小鼠海马CA1区后，结果显示，与STING-shRNA+SAE+Control小鼠相比，STING-shRNA+SAE+PKM2 cKO小鼠的认知障碍并未得到改善。

3.6 增强微内质网自噬通过逆转STING介导的PKM2活性抑制，减轻SAE小鼠的行为学损伤并改善突触可塑性缺陷

在CLP术后第1、2、3天，小鼠海马组织中Sec62和LC3 II/LC3 I蛋白表达水平显著升高，而p62蛋白表达在术后6小时显著降低。过表达Sec62以增强微内质网自噬后，SAE小鼠的认知障碍得到改善，海马CA1区的溶酶体、突触可塑性和神经元存活均显著提升。同时，SAE+AAV-hSyn-Sec62小鼠海马中的ATP/ADP比值、NAD⁺/NADH比值、Sec62、总PKM2、PKM2四聚体/二聚体比率、synapsin 1和PSD95浓度均显著增加。进一步的机制研究表明，Sec62过表达在转录后水平通过自噬-溶酶体途径促进STING降解，而非调节STING的转录或翻译。

4. 讨论与结论

讨论部分总结：研究证实了SAE小鼠模型中存在的认知障碍与海马CA1区神经元丢失和突触可塑性受损相关，并发现这与糖酵解能量供应不足有关。PKM2作为应激状态下驱动糖酵解的关键酶，其在SAE小鼠海马中的表达和四聚体/二聚体比率虽有适应性增加，但不足以提供充分的神经保护。增强PKM2活性能够挽救突触可塑性和认知缺陷，表明PKM2在SAE病理生理中起关键作用。研究揭示STING在SAE小鼠海马中被激活，敲低STING可通过上调PKM2活性改善认知功能，但在PKM2 cKO小鼠中这一保护效应消失，证实了STING通过PKM2依赖途径影响认知。此外，研究还发现增强微内质网自噬（由Sec62介导）可促进STING的自噬性降解，从而解除其对PKM2活性的抑制，增加能量供应，减轻突触损伤，最终改善认知功能。研究者指出了研究的局限性，包括未验证DASA-58的保护作用在PKM2 cKO小鼠中是否完全消失，以及未来需提供STING被转运至溶酶体的直接形态学证据。

研究结论部分翻译：总之，STING介导的PKM2活性抑制引发了SAE小鼠的突触可塑性缺陷和认知损伤，而增强微内质网自噬则逆转了这些病理表型。这一结论可能为SAE的临床治疗提供一个有前景的机制方向。