千金藤属植物长柄千金藤（Long Stephania Herb, LSH）水提物通过调控PI3K/AKT信号通路抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的作用机制研究

《Advances in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences》：Medicinal Compositions of Long Stephania Herb Exhibit Antilung Cancer Effects

中文摘要翻译 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，由于其高死亡率及治疗耐药性，亟需开发低毒高效的治疗药物。长柄千金藤（LSH）是一种临床上用于抗炎和镇痛的热带草药，但其抗肿瘤作用尚不明确。本研究采用超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱联用技术（UHPLC–OE–MS）检测了LSH的化学成分；通过体外细胞实验观察了这些化学成分对正常肺细胞和非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系的细胞毒性作用；并在动物肿瘤模型中检测了LSH对NSCLC生长的抑制作用。研究人员通过网络药理学和分子对接预测了LSH作用于NSCLC的潜在分子靶点。结果表明，LSH含有超过一千种化学成分；在每毫升微克级别浓度下，可有效抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。此外，LSH还能有效抑制体内肿瘤的生长，且对正常肺、肝、心和肾无明显毒性作用。分析显示，LSH的20种药效成分可能靶向EGFR、PIK3CA、PIK3R1、AKT1、HSP90AA1、SRC、MAPK1、MAPK3、STAT3、JUN及CASP3等蛋白。通过抑制PI3K/AKT信号通路及癌症中的蛋白聚糖等相关信号通路，发挥抗NSCLC作用。总之，本研究首次报道了LSH治疗NSCLC的功效，表明其是一种非常有价值的、可用于治疗肺癌的热带药用植物。

论文解读文章

研究背景与目的

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。尽管分子靶向药物的研究取得了显著进展，使得肺癌的五年生存率提升至约25%，但化疗失败、严重不良反应、耐药及疾病进展等问题仍频繁发生。因此，迫切需要寻找安全有效的肺癌治疗药物。传统中医药因其副作用相对较少而被广泛接受，通常具有多靶点治疗的优势。长柄千金藤（LSH）是一种属于防己科千金藤属的热带草药，在中国民间常用于治疗腹泻、水肿、黄疸及蛇虫咬伤，具有抗炎和镇痛等多种药理活性。然而，其对各种癌症，特别是NSCLC的预防和治疗效果此前未见报道。本研究旨在利用网络药理学、分子对接、体外细胞实验和体内动物模型，系统探究LSH对NSCLC的抗肿瘤作用及其潜在的分子机制。

主要关键技术方法

1. 1.
   化学成分分析与筛选：采用超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱联用技术（UHPLC–OE–MS）对采自中国海南省临高县的LSH水提物进行成分鉴定。根据口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18及MS2评分值筛选出20种活性成分。
2. 2.
   网络药理学与分子对接：利用SwissTargetPrediction数据库预测活性成分的作用靶点，并通过GeneCards和OMIM数据库获取NSCLC相关靶点。通过Venny工具筛选交集靶点，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用Cytoscape软件筛选核心靶点并进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。最后，采用DiscoveryStudio2022软件对关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证。
3. 3.
   体外细胞实验：在人NSCLC细胞系（A549、H1299、PC-9）和正常人胚肺细胞（MRC-5）上进行。采用CCK-8法评估细胞活力；克隆形成实验和EdU实验检测细胞增殖；划痕愈合实验和Transwell实验分别评估细胞迁移和侵袭能力；Annexin-V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡；Western blotting检测凋亡相关蛋白（如Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、cleaved PARP1）及p-AKT的表达；光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察细胞形态变化。
4. 4.
   体内动物实验：建立A549细胞皮下异种移植瘤BALB/c-nu裸鼠模型，随机分为对照组（PBS）、LSH低剂量组（300 mg/kg/d）、中剂量组（900 mg/kg/d）和高剂量组（2700 mg/kg/d），连续灌胃给药14天。测量肿瘤体积和重量，并通过Western blotting和免疫组织化学（IHC）染色检测肿瘤组织中相关蛋白的表达。同时，通过血清肝功能标志物（ALT、AST）和肾功能标志物（CREA、BUN）检测及主要器官（肺、肝、心、肾）的苏木精-伊红（HE）染色评估LSH的体内毒性。

研究结果

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  LSH的化学成分分析：UHPLC–OE–MS分析鉴定出LSH水提物中含有超过1000种化合物，并根据OB、DL和MS2评分筛选出20种主要的药效活性成分，包括N-trans-feruloyltyramine、magnoflorine、baicalin、boldine等。
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  LSH治疗NSCLC的网络药理学与分子靶点预测：从20种活性成分中预测到576个作用靶点，并与NSCLC相关的2434个靶点取交集，获得261个交叉靶点。通过PPI网络分析筛选出48个核心靶点，其中排名前十的核心靶点为AKT1、STAT3、EGFR、HSP90AA1、SRC、GAPDH、JUN、BCL2、CASP3和CCND1。KEGG通路富集分析显示，这些靶点显著富集于癌症通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路等。分子对接结果显示，关键活性成分（如N-trans-feruloyltyramine、aurantiamide acetate、eriodictyol等）与其预测的核心靶点（EGFR、PIK3CA、AKT1、HSP90AA1、SRC、CASP3等）均能形成稳定的复合物，证实了其结合能力。
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  LSH在体外抑制NSCLC细胞的生长和侵袭：CCK-8实验表明，LSH能以剂量和时间依赖性方式显著降低A549、H1299和PC-9细胞的活力，其对NSCLC细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）远低于正常MRC-5细胞，显示出选择性细胞毒性。克隆形成实验和EdU实验进一步证实LSH能抑制A549细胞的增殖。划痕愈合实验和Transwell实验证明LSH能有效抑制A549细胞的迁移和侵袭能力。
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  LSH在体外促进NSCLC细胞的凋亡：流式细胞术结果显示，LSH能以剂量依赖的方式增加A549细胞的凋亡率，而对MRC-5细胞无显著促凋亡作用。光学显微镜和TEM观察到LSH处理后的A549细胞出现典型的凋亡特征（如核固缩、碎裂）以及早期焦亡特征（如细胞膜起泡）。Western blotting结果证实，LSH处理上调了cleaved caspase-3和cleaved PARP1的表达，提高了Bax/Bcl-2的比值，并抑制了磷酸化AKT（p-AKT）的水平，表明LSH通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导细胞凋亡。
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  LSH在体内抑制异种移植瘤的生长：在A549细胞异种移植瘤裸鼠模型中，LSH灌胃给药能剂量依赖性地抑制肿瘤体积和重量的增长。Western blotting和IHC染色分析肿瘤组织发现，LSH处理组中cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值升高，而Ki-67和Bcl-2的表达下降，进一步证实了其在体内的抗增殖和促凋亡作用。
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  LSH对正常组织和器官无明显毒性：在动物实验中，各LSH治疗组小鼠的体重与对照组相比无显著差异。高剂量LSH治疗组小鼠的血清肝肾功能指标（ALT、AST、CREA、BUN）以及主要器官（肺、肝、心、肾）的HE染色病理学检查均未发现明显的毒性损伤。

结论与讨论

本研究首次综合运用网络药理学、分子对接、体外细胞实验和体内动物模型，揭示了长柄千金藤（LSH）水提物对非小细胞肺癌（NSCLC）具有显著的抗肿瘤作用。其主要机制是通过靶向EGFR、PIK3CA、AKT1等多个核心蛋白，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，进而抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡。LSH作为一种天然热带药用植物，不仅疗效显著，而且对正常细胞和主要器官的毒性极低，展现出良好的安全性。该研究为将LSH开发为一种新型、低毒的NSCLC临床治疗药物提供了坚实的理论和实验依据。