《Biotechnology and Bioengineering》：Fibroproliferative Remodeling of Immune-Vascular Co-Culture Spheroid Models in Response to Atherogenic Stimulation
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细胞模型是动脉粥样硬化临床前研究的高价值平台，能够提供可控环境以探究疾病机制。三维（3D）球体作为细胞模型的一种，能够在生理相关且可控的条件下研究动脉粥样硬化疾病现象。本研究考察了由THP-1来源巨噬细胞和人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）组成的共培养球体
细胞模型是动脉粥样硬化临床前研究的高价值平台，能够提供可控环境以探究疾病机制。三维（3D）球体作为细胞模型的一种，能够在生理相关且可控的条件下研究动脉粥样硬化疾病现象。本研究考察了由THP-1来源巨噬细胞和人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）组成的共培养球体模型，在经20或40?μg/mL氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）（一种已知的致动脉粥样硬化因子）处理后脂质诱导的变化。在为期10天的观察期内，研究人员评估了球体形态学（大小和紧密度）、细胞活力、代谢活性、细胞内组成、基因表达、促炎细胞因子释放及细胞外基质沉积相对于未处理对照组的变化。脂质暴露在早至第3天即增加了ox-LDL处理球体中巨噬细胞的丰度（LS20-3 h：35.5?±?21.9%；LS40-3 h：38.3?±?8.7%），而对照组为21.8?±?0.7%。同时观察到纤连蛋白（LS20-3 h：约1.8倍；LS40-3 h：约2.1倍）、CD36（约1.8倍）和ABCA-1（约1.9倍）的上调。此外，暴露于40?μg/mL ox-LDL的球体在第10天表现出较20?μg/mL处理组更低的活力和紧密度。虽然脂质处理球体在第0天表现出非统计学显著更高水平的促炎IL-1β细胞因子表达，且至第3天下降（降幅>85%），但所有球体组均表现出相当的全局纤连蛋白ECM分泌指数。综上所述，这些发现揭示了脂质诱导的球体组成和功能性的增生性变化，并展示了其作为研究动脉粥样硬化疾病现象的仿生模型的潜力。
论文解读
一、研究背景与意义
动脉粥样硬化是一种与动脉内脂肪沉积物（“斑块”）形成相关的慢性疾病。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生的始动因素，功能失调的内皮通透性增加，允许低密度脂蛋白（LDL）和胆固醇进入并蓄积于内皮下间隙。循环单核细胞与内皮表达的黏附分子结合后迁移至内膜下，分化为巨噬细胞，摄取脂质后转化为泡沫细胞。同时，健康血管中膜内的平滑肌细胞（SMCs）在动脉粥样硬化环境中获得去分化、增殖性表型，同样可摄取脂质成为泡沫细胞，进一步加剧斑块内炎症。世界卫生组织（WHO）报告指出，由动脉粥样硬化引发的心血管疾病（CVDs）及心肌梗死、卒中等急性事件现已成为全球首要死亡原因。
氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是动脉粥样硬化研究领域广泛使用的致动脉粥样硬化因子，其使用基于体内相关性——ox-LDL已被报道可驱动动脉粥样硬化斑块内的炎症。脂质过量涌入动脉内膜后，巨噬细胞的吞噬清除功能受损，导致效应胞葬作用（efferocytosis）障碍、髓系细胞进一步募集以及促炎微环境的持续存在，从而驱动斑块生长。
体外模型是开展疾病进展临床前研究的重要平台。球体作为三维（3D）细胞模型的一种，依赖细胞自聚集，可用于研究促进疾病进展的直接细胞间相互作用。然而，在动脉粥样硬化临床前研究中，尽管已有利用斑块相关细胞类型（单核细胞、巨噬细胞和/或平滑肌细胞）的二维（2D）模型，三维球体模型的研究仍相对匮乏。近年虽有泡沫细胞球体用于研究载药脂质体的抗炎和胆固醇外排活性，以及包含斑块相关细胞类型的共培养球体用于模拟晚期粥样瘤形成和斑块进展多阶段，但关于球体模型——特别是巨噬细胞-平滑肌细胞共培养球体——在ox-LDL暴露下发生的时序性形态、组成和功能变化的研究仍显著不足。
为弥补这一知识缺口，研究人员开发并优化了包含免疫细胞（THP-1来源巨噬细胞）和血管细胞（原代冠状动脉SMCs）的共培养球体，并考察了其对ox-LDL处理的响应，旨在评估该模型捕获致动脉粥样硬化刺激下早期动态免疫-血管细胞相互作用的能力，为脂质诱导的球体结构和功能调节提供见解，最终增强球体模型在体外动脉粥样硬化相关现象研究中的生理相关性和转化适用性。
二、主要技术方法
研究人员采用琼脂糖微模具（MicroTissues? 3D Petri Dish?）制备球体，以1:1比例直接共培养M0巨噬细胞和SMCs，培养基中添加7.5?μg/mL胶原以支持细胞外基质形成。ox-LDL处理剂量为20?μg/mL和40?μg/mL，孵育时间为3小时。主要检测方法包括：AlamarBlue代谢活性测定、Live/Dead细胞活力染色（Calcein AM/EthD-III）结合共聚焦显微成像、CellTracker荧光标记细胞追踪（巨噬细胞绿色CMFDA、SMCs红色CMTPX）结合Hoechst 33342核染色用于球体大小和紧密度定量、RT-qPCR基因表达分析（纤连蛋白、连接蛋白43、CD36、ABCA-1，以GAPDH为内参）、免疫荧光染色检测纤连蛋白ECM沉积、ELISA检测IL-1β细胞因子释放。统计采用ANOVA和Tukey多重比较检验。
三、研究结果
3.1 无脂质（NLS）球体的活力和功能性
Live/Dead染色显示共培养后第3天即可观察到球体形成。AlamarBlue测定显示，NLS球体与巨噬细胞和SMCs单培养球体组的代谢活性趋势相似：第3至第7天增加（NLS：24.0?±?3.5%至29.3?±?2.8%），第10天下降（21.8?±?1.9%）。组间无统计学显著差异，表明巨噬细胞和SMCs共培养未对细胞健康产生明显负面影响。基因表达方面，SMCs单培养球体表现出纤连蛋白（约1.4倍）、连接蛋白43（约2.0倍）和ABCA-1（约1.5倍）的上调，而巨噬细胞球体CD36表达更高（约0.7倍）。
3.2 脂质处理球体的活力和代谢活性
第3天，脂质处理组与NLS活力相当（NLS：94.7?±?4.4%，LS20-3hr：95.1?±?4.2%，LS40-3hr：94.8?±?5.3%）。至第7天，LS40-3hr活力下降至83.3?±?14.7%，而LS20-3hr维持95.0?±?3.8%。第10天，LS20-3hr（92.0?±?2.8%）与LS40-3hr（85.4?±?7.0%）之间存在统计学显著差异（p?=?0.016）。代谢活性方面，LS40-3hr从第3至第7天呈现约50%的显著增加（p?=?0.0086），第10天各组均下降。
3.3 脂质处理对球体细胞组成、大小和紧密度的影晌
所有球体组在所有时间点均显示SMCs丰度显著高于巨噬细胞。NLS和LS20-3hr球体从第3至第7天大小非显著增加后于第10天减小，LS40-3hr则维持约124?μm的平均大小。所有组从第3至第10天紧密度均显著下降（NLS：0.83至0.48，p?
3.4 脂质处理对基因表达的影响
脂质处理球体表现纤连蛋白上调（LS20-3hr：约1.8倍，LS40-3hr：约2.1倍），其中LS40-3hr与NLS对照差异显著（p?=?0.0367）。连接蛋白43无显著差异。两组脂质处理球体均表现CD36（约1.8倍）和ABCA-1（约1.9倍）上调，CD36表达与NLS对照存在统计学显著差异（LS20-3hr vs NLS：p?=?0.002，LS40-3hr vs NLS：p?=?0.0014）。
3.5 球体中纤连蛋白ECM蛋白表达
免疫染色显示所有球体组均可见纤连蛋白表达。全局ECM分泌指数各组无统计学显著差异（NLS：1.9?±?0.07，LS20-3hr：1.1?±?0.6，LS40-3hr：1.1?±?0.6；LS20-3hr vs NLS：p?=?0.0967，LS40-3hr vs NLS：p?=?0.1964）。
3.6 球体中IL-1β细胞因子表达
第0天脂质处理组IL-1β表达非显著高于NLS（LS20-3hr：78.7?±?24.5，LS40-3hr：75.2?±?16.1 vs NLS：55.4?±?23.1）。至第3天，所有组均大幅下降（NLS下降约90.8%，LS20-3hr下降约94.5%，LS40-3hr下降约88.3%）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，共培养球体中SMCs比例在10天研究期内增加，ox-LDL处理可促进SMC增殖，与体内斑块中SMCs获得增殖能力并迁移至内膜的纤维增生性重塑现象相似。40?μg/mL ox-LDL处理组较高的巨噬细胞比例可能解释了其更大的活力损失易感性，因为脂质蓄积对巨噬细胞的细胞毒性大于SMCs。纤连蛋白、CD36和ABCA-1的上调分别与SMC驱动的纤维增生性斑块重塑、血管平滑肌细胞增殖及ox-LDL摄取后胆固醇外排相关。ECM分泌指数无显著差异可能归因于脂质处理后球体紧密度降低、表面积增大对归一化计算的影响。IL-1β的大幅下降提示球体模型内炎症趋向稳定化。研究还承认未纳入内皮细胞（ECs）的局限性，并指出更长研究周期将有助于捕获钙化、坏死核心形成等晚期重塑事件。
结论部分总结：通过既定实验测定、定量图像分析技术和qPCR，研究人员系统阐明了THP-1巨噬细胞-SMC共培养球体在ox-LDL处理下随时间发生的脂质诱导变化，包括大小、紧密度、活力、代谢活性、细胞内组成、促炎IL-1β细胞因子表达、致动脉粥样硬化基因表达及纤连蛋白ECM表达谱。研究证明这些球体在响应ox-LDL处理时确实经历可观察的组织和功能行为重塑。所得见解可用于设计更稳健且生理相关的动脉粥样硬化研究球体模型，支持纳入更多斑块相关细胞类型和动态流动线索的“更智能”模型开发，长期有望与其他体内和计算机模拟生物医学研究互补，获得具有转化意义的结果。
