《Brain and Behavior》：Sedative Potential of L (+)-Tartaric Acid: Behavioral Evidence With In Silico Insights Into Possible GABAergic Interaction
目的：失眠是一种常见的神经系统疾病，常由应激、焦虑及γ-氨基丁酸能系统（GABAergic system）失衡引起。尽管地西泮（DZP）等苯二氮?类药物（BZPs）为常用处方药，但长期使用伴随依赖性及协调功能受损等不良反应。因此，具有更安全药理特征（pharmacological profiles）的天然替代物日益受到关注。方法：本研究旨在通过体内（in vivo）与计算机模拟（in silico）两种途径靶向γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体，考察天然有机酸L(+)-酒石酸（LTA）的镇静样潜力（sedative-like potential）。采用硫喷妥钠诱导睡眠试验、旷场试验及转棒试验在瑞士白化小鼠中评价镇静样活性。结果：LTA以剂量依赖性方式显著缩短睡眠潜伏期（sleep latency）并延长睡眠持续时间，高剂量（240 mg/kg）效应更为显著；LTA与DZP联用进一步增强硫喷妥钠诱导的催眠作用。旷场试验中，LTA减少自主活动与探究活动，表现为穿格数、直立次数及修饰行为的减少。转棒试验显示LTA剂量依赖性降低运动协调性与神经肌肉表现，但在较低受试剂量下其损伤程度仍轻于DZP所致者。分子对接（molecular docking）显示LTA结合亲和力（binding affinity）低于DZP，但与GABAA受体关键氨基酸（AA）残基形成多个氢键（HB）相互作用，提示其可能与受体形成较稳定的相互作用。结论：行为学与计算学结果共同表明，LTA具有镇静样特性，并可能调节GABA能神经传递（GABAergic neurotransmission）。尚需进一步的机制学、药代动力学及电生理学研究以阐明其确切作用方式与治疗潜力。
研究背景与问题：失眠是以入睡困难或睡眠维持困难为特征的疾病，即便睡眠环境适宜仍可出现，并导致日间功能下降。每年多达37%的普通人群被认为出现短期失眠症状，慢性失眠影响约10%–20%的人群，女性、老年人及社会经济地位较低者患病率更高。失眠常由应激、焦虑、抑郁或噪声、极端温度等不良睡眠条件诱发，也可源于酒精、尼古丁、违禁药物等物质使用或倒班工作。失眠常与躯体和心理健康问题增加、生活质量下降以及事故、医疗资源使用和缺勤等社会负担相关。近年来COVID-19的广泛影响使睡眠相关问题增多。失眠还与性功能障碍、躯体疾病、2型糖尿病、高血压、精神分裂症及心脏病发作等多种健康状况相关。γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统（CNS）的主要抑制性神经递质，通过结合GABA受体（主要为GABA
A与GABA
B）降低神经元兴奋性，维持脑活动平衡并防止过度兴奋。焦虑与睡眠障碍常存在脑内兴奋性与抑制性信号失衡，GABA活性降低可导致神经元放电增强，引起烦躁、紧张与失眠等症状，因此增强GABA能传递是镇静中枢神经系统的常用治疗策略。目前睡眠障碍治疗常包括褪黑素受体激动剂、非苯二氮?类催眠药和BZPs，虽有效但长期使用可致疲劳和协调功能受损等副作用，亟需更安全的治疗选择。天然产物为具有生物活性的化合物，因其治疗特性对药物开发和疾病治疗贡献显著；多酚、萜类、生物碱和皂苷等多种植物化学物与天然助眠剂的镇静特性相关，其中多酚已被充分记载可通过与GABA
A受体相互作用发挥催眠效应。多种草药与膳食补充剂传统上用于治疗睡眠障碍和焦虑，如西番莲（Passiflora incarnata）用于焦虑与失眠、卡瓦胡椒（Piper methysticum）用于缓解紧张与促眠、缬草（Valeriana officinalis）用于改善睡眠质量、酸枣仁（Ziziphus jujuba）用于情绪平衡与改善睡眠，提示天然产物具有较强的镇静特性，可能成为合成助眠药的有效替代物。LTA的IUPAC名称为(2R,3R)-2,3-二羟基丁二酸，属二羧酸和α-羟基酸，天然存在于多种水果尤其是葡萄（Vitis vinifera）中，显著贡献葡萄汁与葡萄酒的酸味。LTA已显示多种药理特性，包括抗高血压、血管舒张、抗寄生虫以及降血糖和降脂作用；其还显示潜在神经学效应，可能与其影响血管机制和受体调节有关。研究显示LTA可抑制二脒那秦（diminazene）诱导的血管舒张，提示其可能参与调节影响脑功能的血管动力学。这些研究提示LTA可能与神经系统疾病相关，但迄今尚无研究专门考察其镇静特性。因此，本研究聚焦于采用小鼠硫喷妥钠诱导睡眠模型评价LTA的镇静潜力，并结合旷场试验与转棒表现试验进行行为学评估，同时针对介导其活性的GABA
A受体亚基开展计算机模拟分析。
主要技术方法：研究采用体内与计算机模拟相结合的策略。体内部分使用瑞士白化小鼠（Mus musculus，体重22–28 g），购自孟加拉国达卡Jahangirnagar大学生畜部门，饲养于Gopalganj科技大学（GSTU）药理实验室，实验方案经GSTU药学系伦理委员会批准（批准号#gstu-20PHR035-01），并遵循ARRIVE指南、NRC实验动物护理与使用指南及OECD-GLP建议。剂量选择依据既往体内研究报道的80与240 mg/kg（无可见毒性体征），DZP标准药剂量为2 mg/kg。关键技术包括：硫喷妥钠（40 mg/kg，i.p.）诱导睡眠试验测定睡眠潜伏期与睡眠持续时间；旷场试验（30 × 30 × 30 cm木质场地）记录穿格数（NSC）、直立次数（NR）与修饰次数（NG）；转棒试验（15 rpm）记录首次跌落潜伏期与跌落次数以评价运动协调与神经肌肉表现；统计学采用单因素方差分析（ANOVA）继以Tukey事后检验。计算机模拟部分以含α1与β2亚基的人GABA
A受体实验解析结构（PDB ID: 6×3X）为靶标，经PyMOL（v2.4.1）去水、去无关链与杂原子并用Swiss-PDB Viewer中GROMOS96力场进行能量最小化；配体LTA（PubChem ID: 444305）与DZP（PubChem ID: 3016）经Chem3D以MM2力场优化；采用PyRx进行对接（网格盒35.02 × 39.37 × 25.00，200步），以Discovery Studio（v21.1.020298）和PyMOL（v2.4.1）可视化相互作用；并以SwissADME、pkCSM与ProTox-3.0预测药代动力学、类药性与毒性。
研究结果：3.1.1 硫喷妥钠睡眠试验——单因素方差分析显示处理对睡眠潜伏期（F(4,20) = 614.2，p < 0.0001，R
2 = 0.9919）与睡眠持续时间（F(4,20) = 531.4，p < 0.0001，R
2 = 0.9907）均有显著效应。对照组入睡潜伏期最长（132.00 ± 2.54 s）；DZP-2显著缩短至60.00 ± 2.44 s（平均差 = 72.00 s，95% CI：65.32–78.68，校正p < 0.0001）；LTA-80与LTA-240进一步缩短至48.80 ± 3.89 s（平均差 = 83.20 s，95% CI：76.52–89.88）与44.00 ± 4.35 s（平均差 = 88.00 s，95% CI：81.32–94.68）（均校正p < 0.0001）；联合组（DZP-2 + LTA-240）潜伏期最短（35.00 ± 3.93 s；平均差 = 97.00 s，95% CI：90.32–103.70，校正p < 0.0001）；LTA-80与LTA-240间无显著差异（平均差 = 4.80 s，95% CI：?1.88–11.48，p = 0.2380）。对照组睡眠持续时间最短（59.20 ± 2.38 min）；DZP-2显著延长至177.00 ± 6.51 min（平均差 = ?117.80 min，95% CI：?131.40至?104.20，校正p < 0.0001）；LTA-80与LTA-240分别延长至221.23 ± 8.17 min（平均差 = ?162.00 min，95% CI：?175.60至?148.50）与226.85 ± 11.87 min（平均差 = ?167.60 min，95% CI：?181.20至?154.10）（均校正p < 0.0001）；联合组睡眠持续时间最长（238.70 ± 0.86 min；平均差 = ?179.50 min，95% CI：?193.10至?165.90，校正p < 0.0001）；LTA-80与LTA-240间无显著差异（平均差 = ?5.61 min，95% CI：?19.18–7.95，p = 0.7299）；各组睡眠发生率均为100%。百分率分析显示，DZP（2 mg/kg）使潜伏期缩短54.75%、睡眠时间增加198.98%；LTA 80 mg/kg效应更强，潜伏期缩短63.19%、睡眠时间增加273.69%；240 mg/kg时潜伏期缩短66.81%、睡眠时间增加283.19%；LTA（240 mg/kg）与DZP联用效应最显著，潜伏期缩短73.60%、睡眠时间增加303.20%，提示两药联用时效增强。3.1.2 对一般运动与探究活动的影响——穿格数总体组效应显著（F(4,25) = 253.952，p = 7.55 × 10
?20，95% CI：0.959–1.000），DZP-2、LTA-80、LTA-240、DZP-2 + LTA-240与对照的差异分别为?49.5（95% CI：?55.5442至?43.4558，p = 3.28 × 10
?14）、?21.0（95% CI：?27.0442至?14.9558，p = 2.05 × 10
?9）、?42.5（95% CI：?48.5442至?36.4558，p = 3.30 × 10
?14）与?56.6667（95% CI：?62.7109至?50.6224，p = 3.28 × 10
?14）。修饰行为组间差异显著（F(4,25) = 8.03，p = 0.000263，95% CI：0.282–1.000），DZP-2与DZP-2 + LTA-240较对照显著减少（平均差分别为?2.8333与?2.50，95% CI：?4.5346至?1.1321与?4.2013至?0.7988，p = 0.000438与0.00188），LTA-80与LTA-240则无显著差异（p = 0.437与0.289）。直立次数组间差异显著（F(4,25) = 27.29，p = 8.45 × 10
?9，95% CI：0.679–1.000），对照与DZP-2（平均差 = ?14.8333，95% CI：?19.4146至?10.2521，p = 8.42 × 10
?9）、LTA-80（?10.1667，95% CI：?14.7479至?5.5854，p = 7.40 × 10
?6）、LTA-240（?10.8333，95% CI：?15.4146至?6.2521，p = 2.63 × 10
?6）及DZP-2 + LTA-240（?13.0，95% CI：?17.5813至?8.4187，p = 1.05 × 10
?7）差异显著。结果表明LTA以剂量依赖方式降低自发运动与探究活动，对照组穿格数（71.33 ± 2.34）、直立次数（25.00 ± 4.05）与修饰次数（3.00 ± 1.26）最高，DZP显著降低全部行为参数，LTA-80与LTA-240亦降低上述参数且高剂量效应更明显，LTA-240与DZP联用对运动与探究活动的抑制最强。3.1.3 对运动协调性的影响——转棒试验中跌落潜伏期受处理显著影响（F(4,25) = 408.798，p = 2.22 × 10
?22，95% CI：0.974–1.000），DZP-2、LTA-80、LTA-240、DZP-2 + LTA-240与NC的差异分别为?47.6944 s（95% CI：?51.8978至?43.4911，p = 3.28 × 10
?14）、?26.4167 s（95% CI：?30.62至?22.2133，p = 3.74 × 10
?14）、?43.3611 s（95% CI：?47.5645至?39.1577，p = 3.28 × 10
?14）与?47.8056 s（95% CI：?52.0089至?43.6022，p = 3.28 × 10
?14），联合组与DZP-2无显著差异（?0.1111 s，95% CI：?4.3145–4.0923，p > 0.9999）。对照组在转棒上停留时间最长（55.00 ± 4.48 s），DZP处理小鼠表现明显下降（7.94 ± 2.14 s）；LTA两剂量均降低跌落潜伏期，LTA-240效应大于LTA-80（LTA-80首次跌落潜伏期38.50 ± 6.72 s、平均潜伏期29.22 ± 13.16 s；LTA-240为11.00 ± 2.28 s与12.28 ± 1.11 s）；LTA-240与DZP联用转棒表现最低。结果提示LTA发挥CNS抑制效应并伴中度运动协调损伤，但较低剂量下损伤程度仍轻于DZP。3.2.1 分子对接与配体-受体相互作用可视化——DZP对GABA
A受体结合亲和力较强（?8.3 kcal/mol），LTA评分较低（?4.8 kcal/mol）；LTA与GABA
A受体在ASN A:265（2.67 ?）和THR A:266（3.48 ?）形成两个氢键；DZP与LEU A:285（3.54 ?）形成单个氢键，并与PHE A:289、PRO B:233、MET B:236、MET A:286和LEU B:232等残基形成多个疏水（HP）相互作用。3.2.2 类药性与药代动力学评估——LTA分子量150.09 g/mol，水溶性高（log S = 0.61），符合Lipinski规则，类药性良好，生物利用度评分0.56；但肠道吸收差（3.709%），Caco-2渗透性低，非P-糖蛋白底物或抑制剂，亦非主要CYP酶底物或抑制剂，提示代谢相互作用低；总清除率中等（0.885 log ml/min/kg），非肾脏OCT2底物。3.2.3 毒性预测——ProTox 3.0预测LTA毒性低，毒性等级5，预测LD50为2497 mg/kg，对肝毒性、神经毒性、免疫毒性、致突变性和致癌性均判为无活性，提示安全性良好、毒理学风险极小。
讨论与结论总结：讨论指出GABA为CNS主要抑制性神经递质，结合GABA
A受体使氯离子内流致神经元超极化，降低兴奋性并抑制信号传递；镇静时GABA活性增强抑制负责警觉与唤醒的脑区，导致意识下降、放松与反应性降低。GABA
A受体为五聚体配体门控氯通道，GABA结合于胞外α1与β2亚基界面的两个正构位点，BZPs则结合于α+/γ?界面变构位点并增强GABA介导的受体活性而非直接激活受体；α1或β2亚基缺失可减弱镇静/催眠药效应，α1介导唑吡坦作用，β2为依托咪酯镇静所必需，β2介导镇静而β3足以产生麻醉。硫喷妥钠（TS）作为巴比妥类经增强GABA
A受体GABA活性诱导镇静，延长氯通道开放时间导致神经元超极化延长和更强的CNS抑制，从而快速起效；但该模型主要反映巴比妥催眠的增强作用，不能完全表征内在镇静活性或区分镇静与运动损伤，故LTA效应应在此背景下解读为镇静样而非确切内在镇静。体内结果显示LTA-80与LTA-240的镇静样效应显著强于对照与DZP-2，LTA-240略强于LTA-80提示剂量依赖性；DZP-2与LTA-240联用效应最显著（潜伏期35.00 ± 3.93 s，睡眠时间238.70 ± 0.86 min），提示增强性相互作用；但研究未进行等剂量比较与完整剂量-反应分析，故不能确立LTA效力强于DZP。既往Ha和Basile（1996）的体外研究显示酒石酸铵可增强[3H]氟硝西泮与GABA
A受体复合物苯二氮?位点的结合，且结合亲和力呈GABA依赖与浓度依赖的双相效应，但该体外结合调节不能直接转化为体内功能或行为结局。旷场试验中LTA剂量依赖性减少穿格、直立与修饰行为，符合CNS抑制剂与镇静剂的行为特征；转棒试验中LTA剂量依赖性降低跌落潜伏期，但低剂量下损伤轻于DZP，提示其行为效应并非仅由严重运动障碍所致，而是以运动活动减少伴中度运动协调损伤为特征的CNS抑制特征，同时运动损伤对行为表型有贡献，故运动减少与硫喷妥钠催眠增强不能完全归因于镇静。LTA与DZP联用对运动活动及转棒表现的抑制强于单用，与睡眠试验中催眠增强相平行，进一步支持LTA可能作用于GABA能神经传递相关通路，但确切机制尚待阐明。研究存在局限：未监测体温与呼吸频率等生理参数；因LTA为二元酸，腹腔给药后可能改变局部pH与渗透压而影响生理、应激反应及硫喷妥钠敏感性，且未设置pH与渗透压匹配对照，故不能完全排除LTA酸性相关理化因素的贡献；LTA剂量远高于DZP，其更强效应不应解读为药理效力更强的证据；LTA结合亲和力较低但形成两个与ASN A:265和THR A:266的有利距离氢键，可能有助于受体稳定；结合亲和力与效能并非同一概念，Kuriyama和Tomono（1986）报道450191-S虽与BZP受体结合很弱，但在动物模型中产生强镇静催眠效应，其镇静作用与低亲和力GABA
A受体结合增强相关，提示药物在GABA
A受体亲和力较低时仍可具有显著镇静样潜力，也可能作为与DZP不同位点的正性变构调节剂。药代预测显示LTA符合全部Lipinski规则且水溶性高，但预测肠道吸收极低（约3.7%），提示未优化制剂时口服不可行；血脑屏障渗透性差（logBB ?0.867；logPS ?3.987）使其能否在药理相关浓度到达CNS存在不确定性，故其转化潜力仍属初步，与GABA
A受体的相互作用应视为假设而非确证，硫喷妥钠催眠增强也可能由间接外周机制或全身效应解释；其低分子量与中等生物利用度、与P-糖蛋白和CYP酶无相互作用等特性支持其作为候选药物的潜力；毒性预测显示低毒（LD50 2497 mg/kg）且各毒性终点无活性，提示安全性良好。结论翻译：总之，LTA在体内表现出显著的镇静样活性，表现为其增强硫喷妥钠诱导的催眠、在旷场试验中抑制运动与探究行为以及在转棒试验中降低运动协调性。这些效应呈剂量依赖性，并在LTA与DZP联用时进一步增强。分子对接分析显示其与GABA
A受体具有有利的相互作用，支持GABA能调节可能参与所观察到的药理效应。尽管确切机制尚待确立，计算机模拟与行为学结果的结合提供了LTA具有CNS抑制与镇静样特性的概念验证证据。今后需开展纳入受体特异性拮抗剂、电生理学研究、药代动力学分析及理化对照的研究，以确认其潜在机制并评价LTA作为候选镇静剂的转化潜力。
