《Clinical and Translational Medicine》：Toward a digital urinary biopsy for early risk stratification in diabetic kidney disease: Anchoring shed cells, vesicles, and cell-free DNA to spatial kidney cell states
编辑推荐：
背景：糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是全球终末期肾病的主要原因。然而，用于定义和分期DKD的白蛋白尿和估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）反映的是已确立的损
背景：糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是全球终末期肾病的主要原因。然而，用于定义和分期DKD的白蛋白尿和估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）反映的是已确立的损伤，无法解析疾病进展异质性背后的细胞异质性。尿液是唯一流经每个肾单位节段的生物体液，携带脱落细胞、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）和游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），每种成分均保留了其来源细胞的信息。
主体部分：本综述提出了数字尿液活检的概念，即通过将这三个组分与空间单细胞肾脏图谱联合解读，以无创方式推断哪些细胞状态处于活跃状态以及微环境相关的分子程序是否被激活，研究人员将此方法称为图谱锚定的分子谱分析。对于每个组分，研究人员列出了研究人群、样本量、处理流程、检测方法、性能及验证状态。由于脱落细胞的RNA、选择性分选的囊泡内容物以及cfDNA甲基化在来源、测量尺度和偏倚方面存在差异，每种组分需要各自独立的参考矩阵、采样函数和背景项。在可行性研究中，所有三种组分均携带肾脏信息，但在DKD中尚无一种成为经过验证的临床检测方法。此外，目前缺乏所需分辨率的cfDNA甲基化参考数据，也没有命名的计算方法在尿液中进行过测试。
结论：因此，研究人员将该框架作为一项结构化的研究假说提出，并定义了所需的验证步骤，从分析验证和临床验证到前瞻性地证明其实用性，并以基于白蛋白尿筛查所遗漏的非白蛋白尿型DKD作为索引用例。该方法提供了一条可检验的途径，以实现细胞水平分辨的无创DKD分期，而非已证实的能力。
1 引言
糖尿病肾病（DKD）是全球慢性肾病（CKD）和治疗后肾衰竭的首要原因，约占所有终末期肾病事件的半数，约40%的2型糖尿病（T2D）患者和30%的1型糖尿病（T1D）患者会发展为DKD。尽管治疗手段取得了进展，包括肾素-血管紧张素系统阻断、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制以及非甾体盐皮质激素受体拮抗剂，但许多患者仍然进展至肾衰竭，主要原因在于干预措施仅在不可逆的结构损伤累积后才开始实施。这种延迟启动反映了用于定义和分期该疾病的生物标志物的局限性。几十年来，Mogensen范式将糖尿病肾病描述为从肾小球高滤过经微量白蛋白尿和蛋白尿最终走向滤过功能下降的固定序列。白蛋白尿和eGFR构成了KDIGO风险矩阵的分层基础。然而，这两者均为晚期且非特异的指标：白蛋白尿反映的是已经确立的肾小球屏障破坏，而基于肌酐的eGFR由于肾功能储备的存在而对早期实质损失不敏感。因此，经典的序列受到了挑战。研究表明，糖尿病患者中与肾脏疾病相关的死亡风险独立于白蛋白尿，而人群研究则确立了非白蛋白尿表型并非罕见而是常见的事实。这种非白蛋白尿表型定义为eGFR低于60 mL/min/1.73 m2但白蛋白排泄正常，占DKD相当大的一部分；荟萃分析显示其患病率为20%至40%，因人群和定义而异。这一定义是功能性的而非病因学的。滤过功能降低伴白蛋白排泄正常可能同样反映血管疾病、衰老、药物影响或既往急性肾损伤发作，而在临床基础上区分糖尿病性与非糖尿病性肾病并不完美：对2012例T2D患者的26项活检研究的汇总分析显示，视网膜病变识别糖尿病肾病的合并敏感性为0.65，特异性为0.75，增殖性视网膜病变的特异性达到0.98，但敏感性仅为0.25。因此，研究该表型需要对白蛋白排泄和滤过功能进行重复测量而非单一数值，同时结合糖尿病病程、视网膜病变状态、用药史以及对非DKD的明确判定。机制上，该表型被认为主要反映肾小管间质和微血管通路而非经典的肾小球通路，这与由小管而非足细胞损伤驱动的急性向慢性转变相一致。由于基于白蛋白尿的筛查对这一通路视而不见，相当一部分患者在晚期才被发现或根本未被发现。
此外，即使在白蛋白尿患者中，疾病进展也具有异质性：潜在类别分析可将稳定患者与快速进展者区分开来，而活检系列研究表明，仅有部分T2D患者表现出经典的糖尿病性肾小球病，其余患者表现为肾小管间质、血管或混合性病变。这种异质性促使我们超越聚合的功能性标志物，转向细胞状态分辨的读数，而其生物学基础现已足够明确，使得这一论点变得具体。慢性高血糖汇聚于一条统一的通路，即线粒体超氧化物过度产生激活多元醇、己糖胺、蛋白激酶C和晚期糖基化终末产物途径，从而单一刺激多样化出多个程序。小管上皮中的线粒体功能障碍将这种应激与受损近端小管的能量衰竭联系起来，而转化生长因子β信号传导则被确定为肾纤维化的主调控因子，驱动间质基质产生的表型。
这些程序在肾脏中的分布并不均匀。糖尿病损伤同时影响肾小球和肾小管间质区室，然而肾小管间质损伤与进展的相关性最强。在此基础上，有研究者提出了小管假说，认为近端小管的过度重吸收和生长驱动了早期的血流动力学和结构改变，将小管定位为起始者而非旁观者。与此一致，分子形态测量学将结构性病变与分子和功能性结局联系起来，而小管损伤标志物则追踪晚期疾病。在细胞类型层面，足细胞耗竭构成肾小球通路的基础，而适应性不良的近端小管反应，包括促炎分泌程序，则驱动肾小管间质通路。遗传易感性进一步决定了哪条通路占主导地位，而糖尿病性与非糖尿病性肾病的频繁共存使单纯依靠临床特征进行分类变得复杂。实验上，将高血糖与肾素依赖性高血压相结合的模型再现了临床上所见到的代谢-血流动力学协同作用，表明存在并发机制。这种多样性，正是聚合标志物所掩盖而细胞状态读数所能揭示的内容。
改进的努力集中于循环和尿液蛋白质生物标志物。一项研究定义了以肿瘤坏死因子受体（TNFRs）为核心的循环炎症特征，该特征可预测进展至肾衰竭。基于这些分析物，KidneyIntelX将血浆TNFR1、TNFR2和肾损伤分子-1（KIM-1）与临床变量结合于随机森林模型中，验证后的曲线下面积接近0.77，优于接近0.62的临床模型。同样，肾衰竭风险方程（KFRE）预测肾衰竭的一致性统计量接近0.90，并作为当前指南的锚点。与此同时，以CKD273特征为代表的尿液蛋白质组学和肽组学分类器在白蛋白尿变得明显之前即可预测进展。这些工具代表了进步，但每种工具都将风险报告为一个标量或固定面板，无法解决哪些细胞过程（肾小球性或小管性、免疫性或纤维化性）处于活跃状态，因此无法指导机制匹配的治疗或捕获内型。
这些局限性引出了本文提出的命题：尿液是一条通往DKD中细胞和空间分辨率的未充分利用的路径。尿液整合了沿整个肾单位的信号，同时携带着来自特定肾脏区室的脱落细胞、EVs和cfDNA。我们将这三种组分的综合解读称为数字尿液活检：将其联合分子含量锚定至肾脏的空间单细胞图谱，以无需穿刺的方式推断患病器官的活跃细胞状态。概念上的进步在于锚定步骤。先前的液体肾脏活检论述只是列举了个别分析物，而本文则将混合的、降解的尿液信号形式化为一个待求解的逆问题，即根据一个带噪声的生物流体观测值，通过图谱先验的正则化，恢复每个细胞状态的组成和微环境相关程序的活性。本叙述性综述的目标是建立该框架并定义其验证所需的条件。因此，本文评估了为什么尿液是通往肾脏的信息丰富窗口及其与组织和血液的比较，考察了每一个分子支柱，调查了锚定图谱，形式化了逆问题及其计算，并明确了生物标志物确认、内型引导的使用案例以及阻碍从概念走向经过验证的临床效用的障碍。
2 尿液作为通往肾单位的信息丰富窗口
尿液读数的基本原理基于一个简单的解剖事实。尿液是唯一流经每个肾单位节段的生物体液，从肾小球滤过屏障经近端小管、髓袢、远端曲小管和集合管，最后通过泌尿道排出。在其流动过程中，它从这些节段中的每一个获取细胞和分子货物，因此尿液的组成总体上反映了肾实质的状态。相比之下，血液取样的是全身区室，因此肾脏来源的物质仅占所测物质的一小部分。因此，尿液的优势在于解剖邻近性和信号富集，这也激发了长期以来对无创液体肾脏活检的追求。支持这一追求的尿液分子内容可分为三个区室。首先，尿液携带从小管上皮和肾小球脱落的完整活细胞，以及浸润的免疫细胞和下泌尿道细胞。其次，它含有EVs，包括外泌体和微囊泡，它们从每个肾单位节段的顶膜出芽，并包裹着反映亲代细胞的RNA、蛋白质和脂质货物。第三，它含有游离核酸，主要是来源于肾脏和泌尿道垂死细胞的cfDNA，其表观遗传标记保留了起源细胞的身份。这些区室是互补而非冗余的：脱落细胞提供最深的单细胞分子表型，但稀疏且脆弱；囊泡丰富且稳定，但报告的是亲代细胞选择性分选的货物；cfDNA稳健且定量，但除非通过甲基化解译，否则细胞分辨率粗糙。综合考虑，三者提供的价值超过任何单独一种。
将数字尿液活检与获取患病肾脏分子信息的两种既定途径，即组织活检和基于血液的液体活检进行比较是有益的。经皮肾活检仍然是诊断的参考标准，但它仅从一个皮质部位取样少数几个肾小球，并且带有操作风险：在118064例原生肾活检中，血肿发生率为11%，需输血的出血发生率为1.6%，死亡率为0.06%。因此，它无法频繁重复以随时间追踪疾病活动度。相比之下，基于血液的液体活检可重复且微创，而肿瘤学中循环肿瘤DNA分析的传统为肾脏应用奠定了统计学和前分析基础。然而，血液将肾脏来源的信号稀释在一个主要由造血贡献主导的系统池中，这限制了对器官特异性细胞状态的敏感性。尿液占据了一个互补的位置。它像血液一样可以无创和重复取样，但又像活检一样在解剖学上富含肾脏来源的材料，并且它在单个标本中独特地保存了完整的细胞以及囊泡和cfDNA。随之而来的权衡是尿液物质更稀疏、更降解，并与下泌尿道贡献相混合，而这正是图谱锚定设计要解决的问题。在这个比较框架中考虑，数字尿液活检最好被理解为不是组织或血液的替代品，而是第三种模式，其独特价值在于纵向、细胞分辨、器官富集的取样。尿液能够报告肾脏病理生理学并非新观点，因为已有的尿液生物标志物已经利用了这一点。KIM-1和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白报告近端小管应激，单核细胞趋化蛋白-1报告间质炎症，表皮生长因子报告远端肾单位的完整性，低浓度尿液表皮生长因子可预测进展。事实上，一项研究使用组织转录组驱动策略提名尿液表皮生长因子作为CKD进展的标志物，直接将尿液蛋白质锚定至肾脏转录组来源。同样，其他研究也表明，在血浆中测量的肾小管损伤标志物可超越白蛋白尿预测糖尿病患者的进展。然而，尿液中相同标志物的证据比通常假设的要弱。在260名患有T2D的皮马印第安人中位随访14年的研究中，尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白与ESKD相关，但将其添加到白蛋白尿和滤过率中后，一致性统计量仅从0.828提高到0.833，研究者判断这一增量不太可能具有临床意义。在尿液中测量的单一分析物对标准标志物的补充如此之少，这本身就是支持细胞分辨率读数的一个论据。综上所述，这些发现确立了尿液分子追踪特定肾脏过程的原理。然而，它们一直缺乏的是细胞分辨率；每个标志物报告的是一个聚合值，无法单独归因于特定的细胞状态或显微解剖微环境。数字尿液活检概念通过用区室范围的分子谱取代单一分析物，并增加将那些谱分配至细胞状态的锚定步骤，扩展了这一既定原理。
