《HUMAN MUTATION》：Thrombophilia-Related Gene Polymorphisms and Recurrent Miscarriages in Lebanese Population: A Case-Control Study
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背景：与心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）相关的基因与特发性复发性妊娠丢失（recurrent pregnancy loss, RPL）存在密切关联。由于这些基因突变常涉及凝血因子（coagulation factors）
背景：与心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）相关的基因与特发性复发性妊娠丢失（recurrent pregnancy loss, RPL）存在密切关联。由于这些基因突变常涉及凝血因子（coagulation factors），抗凝治疗，尤其是低分子量肝素（low-molecular-weight heparin），在黎巴嫩的产科实践中越来越多地用于特定的母体及妊娠相关适应证。然而，描述黎巴嫩产科医师抗凝药物使用流行率及处方模式的数据仍然有限。在这项多中心回顾性病例对照研究中，对具有复发性妊娠丢失史的黎巴嫩女性10个CVD相关基因中的12种突变进行了评估，以揭示这两种疾病之间更多潜在的遗传联系。方法：共收集117例复发性妊娠丢失女性（与同一伴侣在妊娠22周前发生≥2次妊娠丢失）及38例具有至少一次成功妊娠史女性的数据。数据来自黎巴嫩两家独立医疗中心，即Abou Jaoude医院和黎巴嫩诊断医学中心（Lebanese Diagnostic Medical Center），通过病历回顾和受试者访谈获取。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）和反向杂交技术（reverse-hybridization techniques）覆盖12种突变。由于各检测方法基因分型完整性的差异，各多态性位点的有效样本量在对照组为27至38例、病例组为78至117例之间。结果：遗传分析显示，凝血因子V Leiden（Factor V Leiden, FVL）（OR = 0.31；p = 0.017）、凝血因子XIII：V34L（Factor XIII: V34L）（OR = 0.3；p = 0.009）、纤溶酶原激活物抑制剂-1：4G/5G（plasminogen activator inhibitor-1: 4G/5G）（OR = 0.3；p = 0.034）与复发性妊娠丢失的较低风险显著相关。然而，经多重检验校正后这些关联不再显著，因此应视为探索性结果。其他评估的多态性，包括亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）C677T和A1298C，未观察到显著关联。结论：复发性妊娠丢失是多因素的，未必与凝血病相关突变有关；在黎巴嫩人群中，某些多态性显示出与复发性妊娠丢失较低风险的名义关联，需在更大规模的独立研究中加以确认，且本研究中未观察到MTHFR突变与复发性妊娠丢失之间存在统计学显著关联。这些发现提示，在复发性妊娠丢失中常规推定血栓形成倾向病因的做法可能并非普遍适用。未来研究应优先在更大规模、把握度充分的队列中验证这些遗传关联，并在考虑任何治疗学意义之前探索其潜在生物学机制。
研究背景方面，复发性妊娠丢失（recurrent pregnancy loss, RPL）对多数受累女性而言是痛苦且情绪上极具挑战的经历。约15%–25%的临床确认妊娠以流产告终，若计入未识别的早期丢失，流产率可高达全部妊娠的30%–60%。根据美国生殖医学学会（American Society for Reproductive Medicine, ASRM）定义，RPL指妊娠22周前两次或以上的自然妊娠丢失，排除确诊的葡萄胎或异位妊娠，影响0.5%–3%的育龄夫妇。RPL患者属于高危产科人群，其后妊娠中早产、剖宫产及产后出血风险均升高。RPL的发病机制涉及免疫紊乱、血栓形成倾向、抗磷脂综合征、子宫异常、染色体异常、凝血因子、肥胖、母亲年龄、感染及炎症介质多态性等多种危险因素，但高达50%的病例仍为特发性，构成重大挑战。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）将心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）定义为影响心脏和血管的一组疾病。Oliver-Williams等的荟萃分析证明，有妊娠丢失史的患者发生冠心病（coronary heart disease, CHD）的可能性比健康患者高45%，有RPL史者发生CHD的比值几乎翻倍。这种长期流行病学关联虽不必然意味着共享遗传易感性，但提示两种疾病间可能存在共同的潜在血管因素，即二者均可能涉及对全身内皮健康和早期胎盘形成至关重要的血管调节过程紊乱。CVD相关基因突变与RPL的关联已被广泛研究，但结果不一：部分研究提示某些变异具有保护作用，另一些则指出其显著参与RPL发病。2023年Wen等的系统综述与荟萃分析评估了FVL、凝血酶原G20210A（凝血因子II，Factor II, FII）及MTHFR变异与RPL的关联，凸显这些遗传关联在不同人群中的复杂性和矛盾性；2022年欧洲人类生殖与胚胎学会（European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE）指南基于广泛系统综述得出结论，认为FVL、FII和MTHFR多态性与早期RPL关联的证据仍不一致且高度依赖人群。研究人员选择这些特定CVD相关变异，是因其在内皮功能、凝血级联和纤溶中具有关键调控作用：成功早期妊娠需要广泛的滋养细胞侵袭和螺旋动脉重塑，这些过程依赖母胎界面严格调控的局部止血与血管生成平衡；而影响凝血因子V（Factor V, FV）、FII、凝血因子XIII（Factor XIII, FXIII）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）和MTHFR的遗传变异被假设同样可破坏这一精细的胎盘血管重塑。迄今黎巴嫩探索CVD相关基因突变与RPL关联的研究仍有限。El Achi等的研究显示MTHFR（C677T纯合、A1298C纯合及C677T与A1298C复合杂合）和FII（G20210A杂合）突变与RPL存在“强关联”，但该研究用于论证的对照样本中包含生物学男性。尽管缺乏有力的本地遗传学证据，经验性抗凝治疗尤其是低分子量肝素在黎巴嫩RPL女性的产科实践中日益常见，而关于CVD相关突变实际流行率及抗凝处方模式的数据仍有限。在此背景下，本研究提供了一项更新的、多中心的、以女性为重点且更广泛的遗传学评估，生成黎巴嫩女性血栓形成倾向相关多态性与RPL的人群特异性探索性证据。研究人员调查了黎巴嫩女性10个CVD相关基因中12种突变与RPL的关联。
在材料与方法方面，本研究为回顾性多中心病例对照分析，数据来自黎巴嫩两家独立医疗中心，即Abou Jaoude医院妇产科和黎巴嫩诊断医学中心（Lebanese Diagnostic Medical Center, LDC）实验室。研究获LIU机构审查委员会伦理批准（编号LIUIRB-230226-ESA-241），遵循《赫尔辛基宣言》原则，所有患者数据均匿名化和去标识化。病例组共117例RPL女性，定义为与同一伴侣至少有两次妊娠丢失史并被转诊至医学实验室者；排除标准包括既往血栓栓塞事件、已知胎儿死亡、计划性终止妊娠、母体抗磷脂抗体、狼疮抗凝物或抗心磷脂抗体阳性，或任何可能导致妊娠丢失的解剖异常。对照组为38例有至少一次成功妊娠史、无任何妊娠失败、且无个人或家族遗传性血栓形成倾向的女性。两组数据于2023年2月27日至2024年4月22日期间以相同方式收集，由不含研究人员的团队执行，并取得口头知情同意，由见证人记录签署。每次电话访谈约10分钟，参与完全自愿，受试者可随时终止访谈，若拒绝回答后续问题则终止访谈并弃用已收集数据。第一部分获取出生日期、自报体重和身高等基线特征，以及产科史，包括孕次（gravida，确认妊娠次数）、产次（partum，妊娠20周后分娩次数）、流产次数及自首次婚姻以来的连续妊娠丢失次数；第二部分从病历中提取孕妇初次就诊或实验室检查时的年龄，并记录遗传性CVD panel检测的实验室结果。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用回顾性多中心病例对照设计，样本来自黎巴嫩Abou Jaoude医院妇产科与LDC实验室两家中心，纳入117例RPL病例与38例对照，于2023年2月至2024年4月通过病历回顾和约10分钟电话访谈收集数据。基因分型采用两种平台：在Abou Jaoude医院，对FVL（G1691A）、MTHFR（C677T）和MTHFR（A1298C）三种最常见突变采用实时PCR（LightMix试剂盒，Roche LightCycler 96系统），其余九种突变采用反向杂交条带法（CVD StripAssay，ViennaLab），经PCR扩增后与等位基因特异性寡核苷酸探针反向杂交；在LDC采用基于Taq聚合酶5′核酸外切酶活性的多重实时定量PCR（qRT-PCR）。统计分析使用SPSS 23.0，采用二元logistic回归计算各遗传模型（共显性、显性、隐性）的比值比（odds ratio, OR）及95%置信区间（confidence interval, CI），并以精确检验评估Hardy–Weinberg平衡，采用Benjamini–Hochberg错误发现率（false discovery rate, BH-FDR）校正多重比较，并对名义显著位点进行事后把握度分析。
研究结果方面，3.1 病例与对照的产科史：共纳入155例受试者，包括117例不明原因妊娠丢失病例和38例妊娠平顺的健康女性。受试者平均年龄34.0岁（标准差6.3岁），病例组与对照组平均年龄分别为34.4岁和32.6岁，差异无统计学意义（p = 0.129）；体质指数（body mass index, BMI）在两组间亦无显著差异（对照组24.7 ± 5.3，病例组25.5 ± 5.2，p = 0.696），表明队列在年龄和BMI方面匹配良好。与对照组相比，有不明原因RPL史的女性孕次（中位数4，范围2–13）和妊娠丢失次数（中位数2，范围2–12）显著更高，产次（中位数1，范围0–6）更低；对照组孕次中位数为1（范围1–4），产次中位数为1（范围1–4），妊娠丢失次数为0。3.2 基因分型结果：FVL结果显示，纯合变异基因型在对照组占23.7%、病例组占8.5%（OR = 0.31；95% CI 0.113–0.817；p = 0.020）；显性模型（合并GA与AA基因型）无统计学意义（OR = 0.476；95% CI 0.202–1.120；p = 0.089）；隐性模型（仅AA基因型）显示与RPL较低风险显著相关（OR = 0.301；95% CI 0.112–0.810；p = 0.018）。对于凝血酶原基因突变（G20210A），对照组（10.5%杂合、0%纯合）与病例组（11.1%杂合、5.8%纯合）基因型分布无显著差异，显性和隐性模型均无统计学显著关联（p > 0.05）。MTHFR C677T和MTHFR A1298C多态性在显性或隐性模型中均未见与RPL的显著关联。FXIII：V34L杂合基因型在病例组占29.1%、对照组占59.3%（OR = 0.288；95% CI 0.116–0.733；p = 0.007）；显性模型（合并GA与AA）OR为0.3（95% CI 0.121–0.742，p = 0.009），提示FXIII V34L变异与RPL较低风险相关；隐性模型未见显著关联。PAI-1：4G/4G纯合基因型在对照组12例（44.4%）、病例组18例（22.7%）（p = 0.046）；显性基因型（杂合携带者与纯合突变）在对照组25例（92.6%）、病例组63例（79.7%），差异无统计学意义（p = 0.142）；隐性基因型（纯合突变）在对照组12例（44.4%）、病例组18例（22.7%）（p = 0.034），提示PAI-1 4G/4G隐性基因型模型与RPL较低风险相关。其余CVD基因，包括FV（R2）H1299R、β-纤维蛋白原?455G>A、血小板糖蛋白IIIa（platelet glycoprotein IIIa, GPIIIA）HPA 1: a/b、血管紧张素I转换酶（angiotensin I-converting enzyme, ACE）插入/缺失及载脂蛋白E（apolipoprotein E, Apo E），均未观察到统计学显著关联；载脂蛋白B（apolipoprotein B, Apo B）R3500Q在所有受试者中均为野生型。3.3 统计把握度：对三个达到名义显著的位点进行事后把握度分析，检测FVL隐性关联（38例对照、117例病例）的把握度为62.0%，FXIII V34L关联（27例对照、79例病例）为75.3%，PAI-1 4G/5G隐性关联（27例对照、79例病例）为54.9%；在观察到的病例对照比例下，要达到80%把握度需约49–58例对照。3.4 Hardy–Weinberg平衡与多重比较校正：除FVL G1691A（精确p < 0.0001）外，所有多态性均符合Hardy–Weinberg平衡预期。针对12种多态性评估，对全部32项统计学有效比较应用Bonferroni和BH-FDR校正后，六个名义显著关联均不再显著（Bonferroni p = 0.224–1.000；FDR q = 0.144–0.245）。
讨论部分总结：研究揭示了CVD相关遗传多态性与RPL关联的复杂性和人群特异性。与既往多项研究的假设相反，本研究发现某些多态性与RPL较低风险相关，但应谨慎解读，因其可能反映人群特异性遗传特征而非直接的保护性生物学效应。研究优势在于选择女性作为对照，可在同一生物学背景下比较；局限在于样本量相对有限及病例对照不平衡。凝血因子FV兼具促凝和抗凝双重功能，FVL为对活化蛋白C（activated protein C, APC）抗凝反应受损的遗传性疾病，其与RPL的关系长期存在争议；本队列中FVL纯合基因型在对照组更常见，与RPL较低风险相关，但无实验或临床证据表明FVL突变在早期妊娠中具有生物学优势或“保护作用”，观察到的关联可能反映情境依赖性基因–生理相互作用，需在更大规模多民族研究中验证。FII（凝血酶原）多态性与RPL无显著关联，与既往部分研究一致。MTHFR 677C>T和1298A>C变异全球广泛分布，60%–70%的人携带至少一种，约10%为纯合或复合杂合；本研究未发现MTHFR突变与RPL关联，当前证据不支持仅基于MTHFR多态性使用抗凝治疗，且部分口服抗凝药可穿过胎盘并与中枢神经系统异常、胎儿出血、面部异常及潜在智力问题相关，建议携带MTHFR突变的孕妇继续补充叶酸，但明确临床建议仍需随机对照试验证据。FXIII是凝血级联的最终因子，独特地通过交联纤维蛋白稳定血凝块；其他研究亦显示突变等位基因在对照组频率更高，但其生物学机制仍不清楚。PAI-1属丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）家族，调控纤溶酶原/纤溶酶系统，其4G/5G多态性位于?675位点的插入–缺失突变；本研究中该多态性在对照组更常见（44.4%对22.7%），与RPL较低风险相关。对于FXIII V34L和PAI-1 4G/5G，目前无明确生物学机制解释其抗RPL保护效应，这些变异通常被认为以理论上增加而非降低血栓风险的方式改变纤维蛋白凝块结构或纤溶活性，因此所观察到的意外“保护性”关联极可能是样本量有限导致的虚假发现而非真实生物学效应。其他可能解释包括：样本量有限尤其对照数少降低统计把握度并增加I类错误；不同位点基因分型的技术问题或批次效应不能完全排除；病例组高度异质（既往丢失次数、丢失时孕周、原发与继发性RPL不同）可能稀释真实遗传效应或引入混杂。研究局限包括：样本量小、对照有限及病例对照不平衡可能降低检测 modest 遗传效应的把握度并增加偶然发现风险；评估多种多态性增加多重检验假阳性可能，BH-FDR校正后无关联保持显著，故所报告关联应视为探索性；病例组同时纳入原发和继发性RPL可能引入异质性；12种突变中8种的数据仅来自单一招募中心，导致部分分析样本量减少；某些变异偏离Hardy–Weinberg平衡可能反映抽样变异、人群特征或方法学因素；研究人群仅为黎巴嫩女性，限制外推性；基因分型在两个招募中心使用两种实验室方法，存在位点相关方法学偏倚可能，尽管敏感性分析显示基因型×位点交互作用无统计学意义且校正招募中心后估计关联变化极小，仍建议在更大队列中以单一平台和标准化方法重复验证。
研究结论翻译：RPL是多因素的，未必与导致凝血病的突变相关。在这项病例对照研究中，研究人员评估了黎巴嫩女性10个CVD相关基因与RPL之间的潜在遗传联系。尽管既往研究显示FVL、FXIII：V34L和PAI-1：4G/5G突变与RPL强相关，但本研究结果未证明这些变异与RPL易感性增加相关；相反，某些多态性在对照组中更常见，导致在研究黎巴嫩人群中与RPL较低风险相关。然而，鉴于本研究的观察性本质及其局限（包括样本量相对较小和多重比较校正后统计学显著性丧失），这些保护性关联必须被解释为初步发现，需在更大规模、独立且把握度充分的研究中确认，而不应视为已确立的生物学效应。此外，本研究中未观察到MTHFR多态性与RPL之间存在统计学显著关联。这些发现与越来越多质疑MTHFR变异作为妊娠丢失独立决定因素之临床相关性的证据一致。因此，RPL女性的管理决策应以已确立的临床危险因素而非仅凭遗传多态性状态为指导。未来研究应优先在更大规模、把握度充分的队列中验证所观察到的遗传关联，并在考虑任何治疗学意义之前探索其潜在生物学机制。更深入地理解导致RPL的复杂遗传、环境和生活方式因素，最终将有助于指导循证临床实践并改善受累女性的结局。
