《Food Science & Nutrition》：Study on the Correlation Between Fermentation Microbial Communities and Flavor Compounds in Sauerkraut
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本研究旨在探究成熟酸菜发酵过程中微生物群落结构及其与风味物质的关联。采用DNA高通量测序（high-throughput sequencing）与气相色谱-质谱联用技术（GC–MS）分析发酵第20天酸菜样品的微生物群落与挥发性风味物质。共鉴定出104种挥发性化
本研究旨在探究成熟酸菜发酵过程中微生物群落结构及其与风味物质的关联。采用DNA高通量测序（high-throughput sequencing）与气相色谱-质谱联用技术（GC–MS）分析发酵第20天酸菜样品的微生物群落与挥发性风味物质。共鉴定出104种挥发性化合物，包括醛类（28.98%）、醇类（3-甲基-1-丁醇，18.28%）、酯类（硫代乙酸甲酯，3.14%）及有机酸类（乙酸，4.28%）。这些化合物与酸菜特征性的酸味、果香及青草香香气轮廓相关。微生物群落分析表明，细菌多样性高于真菌，厚壁菌门（Firmicutes，69.37%）与变形菌门（Proteobacteria，29.92%）为优势菌门。肠球菌属（Enterococcus）与乳球菌属（Lactococcus）合计占细菌群落的50%以上，为与发酵特性相关的优势类群。这些微生物可能通过碳水化合物利用、氨基酸代谢及挥发性化合物形成等相关代谢活动参与风味形成。相关性分析进一步表明，乳球菌属、肠球菌属与多种乙酸酯类之间存在显著正相关关系，提示这些菌属与该类化合物的积累存在密切的统计学关联。本研究为酸菜微生物群落结构与风味轮廓之间的关联提供了进一步证据，为传统发酵食品工艺优化与品质提升提供了科学依据。
研究背景：酸菜作为传统发酵蔬菜制品，因独特风味与丰富营养价值而广受欢迎，富含维生素C、膳食纤维及多种微量元素，具有促进消化、增强免疫等健康益处。据中国食品工业协会统计，我国腌菜年产量超过400万吨，市场规模持续扩大，具有显著产业潜力。酸菜独特风味源于乳酸菌等微生物在厌氧条件下的发酵活动，发酵过程可优化其风味并提升营养价值。微生物群落结构随发酵发生显著动态变化，与产品安全性和风味特征密切相关。然而现有研究存在若干局限：多聚焦单一微生物类群而忽视多物种互作对风味形成的协同效应；风味物质鉴定过度依赖靶向分析，难以全面刻画挥发性组分；多停留于现象学相关性分析，未进一步验证关键功能微生物的代谢途径。此外，传统自然发酵微生物区系复杂且不稳定，易导致感官品质不一致甚至潜在安全风险。因此，阐明酸菜发酵过程中微生物演替与风味形成的相关性，对理解微生物动态内在规律、指导工业实践、优化发酵工艺及提升产品品质均具有重要意义。发酵过程中乳酸菌代谢糖类产生乳酸、乙酸等有机酸，同时降解蛋白质、脂质等大分子生成氨基酸、游离脂肪酸等风味化合物，共同赋予发酵酸菜特征性的酸、甜、鲜及脆爽口感；乳酸菌的菌种组成与丰度直接影响发酵进程与终产品品质。本研究以新鲜酸菜为原料经低温自然发酵制备酸菜，采用DNA高通量测序与气相色谱-质谱联用技术（GC–MS）研究微生物群落结构与风味化合物的相关性，研究结果可为我国传统乳酸发酵蔬菜的菌株水平食品安全评估与工艺控制策略提供参考。
关键技术方法：研究以山西省当地农贸市场采购的新鲜酸菜、发酵罐及食品级盐为材料，将白菜（Brassica rapa pekinensis）分层装罐，按总重3%（w/w）添加食盐，密封后于约10°C（波动2°C–3°C）条件下自然发酵20天。微生物群落分析采用高通量测序：扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区（引物F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA；R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT）及真菌ITS1区（引物F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；R: GCTGCGTTCTTCATCGATGC），由北京百迈客生物科技有限公司在Illumina平台完成扩增与测序，原始序列经QIIME2（v2021.4）质控处理。风味组分采用顶空-气相色谱-质谱联用测定：样品研磨匀浆后取2 g固体与2 mL发酵液，分别转入20 mL顶空瓶并加入2 mL分析纯饱和氯化钠（NaCl）溶液后密封；顶空进样器（Agilent 7697A）参数为炉温110°C、定量环120°C、传输线130°C、平衡10 min；GC采用HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），高纯氦气（99.999%）为载气，流速1.0 mL/min，分流比5:1，进样口250°C，程序升温为40°C保持3 min，以5°C/min升至150°C，再以10°C/min升至250°C并保持5 min；质谱采用电子轰击（EI）源，70 eV，离子源温度250°C，全扫描范围m/z 35–400。数据经仪器配套定性分析软件处理，采用Microsoft Excel 2010与SPSS 23.0统计计算，Origin 2021可视化。
研究结果：
3.1 发酵酸菜挥发性风味化合物分析：通过GC–MS共检测出104种挥发性风味化合物，分为29种醇类、26种酯类、23种醛类、7种酮类、5种烃类、4种有机硫化合物、2种有机酸及8种其他类化合物。醛类相对含量最高（28.98%），以5-羟甲基糠醛（12.34%）与糠醛（7.24%）为主要贡献者，分别赋予焦糖香与坚果香；该高丰度与十字花科蔬菜特征性挥发轮廓一致，表明醛类在界定发酵酸菜特征风味中居核心地位。醇类中3-甲基-1-丁醇（18.28%）呈苹果酒样香气并略带辛辣感，1-己醇（0.42%）呈清新脂肪醇气息与青果、黄瓜香，α-松油醇（2.15%）呈薰衣草、松木或樟脑样香气，共同丰富并协调风味复杂度。酯类虽相对含量低于醇类，但硫代乙酸甲酯（3.14%）贡献明显果香，乙酸异龙脑酯（2.47%）呈木香与松香，与醇、醛等协同构成丰富和谐的风味轮廓。
3.2 发酵酸菜微生物多样性分析：Alpha多样性分析显示所有样品序列覆盖度达0.99，样本文库覆盖深度高；细菌Shannon与Simpson指数高于真菌，提示细菌多样性更高，而真菌Chao1与ACE指数更高，表明真菌物种丰富度更高。稀释曲线分析基于16S rRNA基因与ITS1区测序数据，曲线趋于平台，说明测序深度足以捕获大部分细菌与真菌物种，数据覆盖度高，可全面反映群落多样性。属水平上，优势细菌为乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）与明串珠菌属（Leuconostoc）；乳球菌属与肠球菌属作为典型乳酸菌（LAB）合计丰度>50%，与核心风味轮廓形成密切相关，可通过产酸及代谢活动参与风味形成，经降解蛋白质生成游离氨基酸提升鲜味与风味复杂度，并影响醇、醛、酯等挥发性化合物合成。不动杆菌属相对丰度约15%，可能参与发酵初期环境适应与底物利用，但其代谢产物可能与不良风味风险相关；芽孢杆菌属丰度较低，可能通过分泌蛋白酶与脂肪酶促进大分子降解，间接影响风味前体积累。门水平上，厚壁菌门（Firmicutes，69.37%）与变形菌门（Proteobacteria，29.92%）合计超过99%，其中厚壁菌门内乳酸菌为核心功能菌群，产乳酸、乙酸等有机酸，赋予酸味并抑制不良微生物以保证发酵安全；拟杆菌门（Bacteroidota）与放线菌门（Actinobacteria）丰度均<1%，可能参与蛋白质降解或风味前体生成等特定代谢途径。真菌属水平以unclassified_Fungi绝对优势（53.79%），其次为unclassified_Chytridiomycota（3.11%）与unclassified_Basidiomycota（1.85%）；可鉴定属中检出链格孢属（Alternaria，0.37%）、红酵母属（Rhodotorula，0.36%）与枝孢属（Cladosporium，0.32%）等常见环境真菌，可能来源于原料或发酵环境，其分泌纤维素酶或蛋白酶等代谢活动可能促进底物降解与风味前体形成。真菌门水平以unclassified_Fungi（53.79%）与壶菌门（Chytridiomycota，33.49%）为主，子囊菌门（Ascomycota，4.10%）、担子菌门（Basidiomycota，3.86%）与罗兹菌门（Rozellomycota，4.36%）丰度较低；子囊菌门丰度偏低可能与低温发酵环境抑制部分中温真菌生长有关，被孢霉门（Mortierellomycota）与球囊菌门（Glomeromycota）等稀有门（合计<1%）的检出提示群落内存在复杂生态互作。
3.3 微生物与挥发性风味化合物相关性分析：通过相关性热图分析表明，优势菌属与多种挥发性风味化合物显著相关；属水平上乳球菌属与肠球菌属同多种乙酸酯类呈强正相关（深红色），提示其在这些风味化合物形成中的潜在作用；不动杆菌属与硫代乙酸甲酯、δ-壬内酯及多种酯类呈正相关，提示其可能参与含硫化合物代谢与脂质来源风味转化；假单胞菌属（Pseudomonas）与沙雷菌属（Serratia）同多种醇类和酯类呈负相关，提示其丰度变化可能与某些挥发性化合物积累减少相关。门水平上厚壁菌门与多种挥发性化合物尤其醇类和酯类呈正相关，凸显其在发酵风味形成中的潜在贡献；变形菌门与不同挥发性化合物呈正负双重相关，表明其与风味形成的复杂关联。上述结果阐明特定细菌属对酸菜挥发性风味化合物形成的影响，乳球菌属与肠球菌属作为发酵优势微生物可能通过代谢活动密切参与风味轮廓塑造，负相关结果则提示这些菌属可能抑制某些风味化合物的生成或转化。相关性分析表明酸菜发酵过程中微生物群落结构显著影响风味物质形成，乳球菌属与肠球菌属可作为未来筛选发酵剂以改善酸菜风味一致性的候选靶标。
讨论部分：本研究采用高通量测序与GC–MS探究酸菜微生物群落结构与风味化合物的相关性。GC–MS共鉴定104种挥发性风味化合物，醛类占相对含量28.98%，为特征风味轮廓的主要贡献者，其高比例与十字花科蔬菜典型挥发轮廓一致。细菌以厚壁菌门和变形菌门为优势门，肠球菌属和乳球菌属为优势属；真菌群落中未分类序列比例较高，可能反映现有真菌参考数据库的局限或发酵环境中存在研究不足的物种。相关性分析显示肠球菌属与乳球菌属同多种乙酸酯类呈显著正相关，提示其对果香化合物积累的潜在贡献，尚待代谢验证。本研究中肠球菌属与乳球菌属的优势地位与中国其他传统发酵酸菜体系中乳球菌属和乳杆菌属与挥发性风味代谢物显著正相关的近期报道基本一致，但本研究的属水平组成特别是肠球菌属的高相对丰度与该研究中乳杆菌属占优势不同，此差异可能反映本研究采用的低温高盐发酵条件以及原料与地区微生物接种来源的差异。值得注意的是，肠球菌属虽在许多发酵食品中对风味形成有功能性贡献，但该属某些菌株被认定为机会致病菌及抗生素抗性基因携带者；由于本研究未进行菌株水平鉴定与安全筛查，未来工作应结合优势肠球菌群体的基因组特征分析，以在确认其风味功能贡献的同时明确其食品安全状况。本研究选择第20天作为采样点，是因为在约10°C低温条件下该时间点通常被视为酸菜发酵接近微生物成熟度的常用终点，与本品常见工业实践一致；但仅分析这一单一成熟阶段时间点无法捕捉整个发酵过程中微生物群落与风味化合物的动态演替，也无法追踪特定类群的消长。此外，本研究未监测pH、可滴定酸度、盐分动态或糖消耗等理化参数，而这些参数已知可塑造微生物代谢并进而影响风味化合物形成。上述局限限制了推断微生物类群与风味化合物之间因果关系及机理解释所观察相关性的能力，未来研究应纳入覆盖全发酵期的多时间点采样并同步进行理化监测，以更全面阐明微生物区系、环境条件与风味形成之间的动态互作。
结论翻译：本研究采用高通量测序与GC–MS探究了酸菜微生物群落结构与风味化合物之间的相关性。共鉴定出104种挥发性风味化合物，以醛类（28.98%）、醇类（3-甲基-1-丁醇，18.28%）和酯类（硫代乙酸甲酯，3.14%）为主，而乙酸（4.28%）等有机酸贡献了发酵酸菜特征性的酸味。厚壁菌门与变形菌门为优势门，肠球菌属与乳球菌属为优势属，可能与风味形成相关。相关性分析显示这两个菌属与多种乙酸酯类呈显著正相关，提示其对果香化合物积累的潜在贡献；确认因果关系仍需进一步的代谢验证。总体而言，这些结果为连接酸菜微生物区系与风味化合物积累提供了工作框架，有助于为未来机理与应用研究优先锁定目标类群。然而，由于本研究基于单一发酵时间点且未同步进行理化监测，所观察到的关系应视为初步的和相关性的。今后有必要开展结合多时间点动态采样、理化监测与代谢验证的研究，以确认这些关联并进一步阐明其潜在机制。
