《Food Science & Nutrition》：Influence of Drying Methods on Phytochemical Retention of Moringa oleifera Leaves and Green Synthesis of Zinc Oxide Nanoparticles Using the Optimal Moringa oleifera Leaf Extract
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利用植物提取物绿色合成氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）是一种环境友好型途径，然而叶片干燥预处理对纳米颗粒合成的影响仍研究不足。本研究首先评价了辣木（Moringa oleifera）叶片经风干、晒干、烘干和冷冻干燥处理对植物化学物保留的影响，随后采用性能最佳干
利用植物提取物绿色合成氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）是一种环境友好型途径，然而叶片干燥预处理对纳米颗粒合成的影响仍研究不足。本研究首先评价了辣木（Moringa oleifera）叶片经风干、晒干、烘干和冷冻干燥处理对植物化学物保留的影响，随后采用性能最佳干燥处理所得提取物进行ZnO-NPs的绿色合成。冷冻干燥叶片保留了最高水平的酚类、黄酮类、维生素C和β-胡萝卜素，因而被选作纳米颗粒合成的唯一前体。气相色谱–质谱联用（GC–MS）和高效液相色谱（HPLC）证实了负责Zn2?络合与纳米颗粒稳定的生物活性化合物的存在。合成的ZnO-NPs在365 nm处呈现特征性紫外–可见（UV–Vis）吸收峰，带隙为3.40 eV。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、动态光散射（DLS）和zeta电位分析证实形成了高结晶度、花状形貌的ZnO-NPs，粒径为45–82 nm（流体动力学直径约67 nm），并具有优异的胶体稳定性（?32 mV）。与分析纯ZnO相比，生物合成的ZnO-NPs表现出显著更高的抗菌和抗氧化活性、更快的自由基清除动力学以及优异的贮藏稳定性。上述发现表明，冷冻干燥是制备稳定且具有生物活性的ZnO纳米颗粒的有效预处理方式，可用于食品和生物医学应用。
**一、研究背景与问题提出**
纳米技术是一门新兴且快速发展的学科，在生物医学、化妆品、食品包装、农业和环境保护等多个领域提供了新颖的应用。近年来，通过传统（物理和化学）方法与绿色合成技术制备金属纳米颗粒的需求持续上升。其中，绿色合成因使用植物、细菌、真菌和藻类等生物制剂而被公认为优选替代方案，具有毒性低、经济可行、环境兼容以及可通过天然生物分子精细调控颗粒尺寸和形貌等多重优势。植物基纳米颗粒合成尤受关注，主要原因在于植物提取物含有多种有益化合物，可显著影响纳米颗粒有利的物理化学特性。在众多纳米材料中，ZnO-NPs因其独特的物理化学性质（半导体特性、紫外光吸收以及强抗菌和抗氧化作用）而被广泛研究，且ZnO被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为一般公认安全（GRAS）物质，使其在对抗微生物感染、氧化应激和炎症方面具有前景。
辣木被誉为"奇迹植物"，以其丰富的营养组成和大量植物化学化合物（包括多酚、黄酮类、萜类、单宁和皂苷）而闻名。干燥是保存植物材料、延长货架期和便于后续加工的常用技术。研究表明，冷冻干燥、风干和烘干等不同干燥方式会显著影响叶类蔬菜和药用植物中营养素及生物活性化合物的保留。冷冻干燥（ lyophilization）利用低温和真空使冰升华，可最大限度减少结构损伤并保留热不稳定化合物；风干依赖环境空气逐步去除水分，简单经济，但长时间干燥可降解敏感化合物；晒干利用太阳能脱水，成本低，但温度波动和直射阳光可能导致挥发性和生物活性化合物损失；烘干预先控制加热以加速水分去除，干燥均匀但可能损害热敏性营养素和抗氧化剂。
尽管已有大量关于利用辣木提取物绿色合成ZnO纳米颗粒的报道，但干燥预处理对植物化学物保留的影响及其对纳米颗粒形成和生物学性能的后续影响仍很大程度上未被探索。具体而言，尚不清楚哪种干燥方式最能保留负责纳米颗粒还原、包覆和稳定的生物活性成分，以及这些变化如何影响所合成ZnO-NPs的抗氧化和抗菌特性。因此，本研究系统比较了辣木叶的冷冻、风干、晒干和烘干处理，以确定最能保留植物化学物的预处理方式，随后仅采用最优（冷冻干燥）提取物进行ZnO纳米颗粒的绿色合成与全面表征。本工作的新颖性在于通过两阶段实验设计确立：（i）干燥预处理与辣木叶植物化学物保留之间的关系；（ii）由性能最佳（冷冻干燥）提取物后续合成的ZnO纳米颗粒的功能性能，从而为植物介导纳米颗粒生产中选择合适预处理策略提供实用见解。
**二、主要关键技术方法**
研究人员所用主要关键技术方法包括：采用四种干燥方式（冷冻干燥?50°C、真空<0.1 mbar、48 h；风干25±2°C、相对湿度60%±5%、72 h；晒干30–35°C、24 h；烘干40°C、18 h）制备辣木叶粉，鲜叶样品（约2.5 kg，采自15–20株成熟树）来源于孟加拉国应用营养研究与培训研究所（BIRTAN，Araihazar，Narayanganj，孟加拉国，23.635°N，90.687°E）。采用分光光度法测定维生素C、β-胡萝卜素、总酚（Folin–Ciocalteu法）、总黄酮（氯化铝比色法）、DPPH自由基清除、单宁、皂苷和植酸含量；采用GC–MS（Shimadzu GCMS-QP2020，DB-5MS柱）鉴定冻干提取物中挥发性和半挥发性成分；采用HPLC（Agilent 1260 Infinity II，ZORBAX Eclipse Plus C18柱）定量酚酸和黄酮类化合物；以醋酸锌二水合物（0.272 mol）与植物提取物在80–90°C反应2–3 h后经18 h静置、离心和50°C干燥合成ZnO-NPs；采用UV–Vis、FT-IR、SEM、EDS、DLS、zeta电位和XRD进行表征；采用纸片扩散法评价对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性；采用DPPH法评价抗氧化活性并建立准一级动力学模型；采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey氏诚实显著性差异（HSD）检验进行统计分析。
**三、研究结果**
**3.1 辣木叶粉的植物化学、抗营养及抗氧化特性**
不同干燥处理有效将鲜叶初始水分含量（76.8%±0.5%）降至终水分水平，证实脱水成功。冷冻干燥叶片水分含量最低（3.48%±0.02%）、水分活度最低（0.44±0.01），烘干叶片最高（分别为5.94%±0.03%和0.69±0.02）。冷冻干燥保留了最高水平的维生素C（52.75±0.28 mg/g）、β-胡萝卜素（0.255±0.004 mg/g）、酚类（68.42±0.15 mg GAE/g DW）和黄酮类（62.36±0.70 mg QE/g DW），烘干造成最大损失。晒干叶片虽保留较高酚类（51.03±0.18 mg/g）和黄酮类（46.18±0.85 mg/g）含量，但抗氧化活性最低（336.84±0.09 mg/mL），这是唯一抗氧化能力未随酚类含量变化的参数，可能归因于长时间直射阳光紫外暴露和温度波动选择性降解维生素C和β-胡萝卜素等高度紫外和热不稳定的非酚类抗氧化协同成分。单宁含量在各干燥方式间均较低（0.05–0.06 mg/g），皂苷在冻干叶片中最高（16.22±0.85 mg/g）、烘干最低（7.18±0.60 mg/g），植酸在风干中最高（88.92±1.02 mg/g）、烘干最低（58.63±1.28 mg/g）。总体而言，冷冻干燥最有效地保留了辣木叶的营养和功能品质，其次为风干和晒干，烘干因长时间热暴露造成最大降解。基于其优越的生物活性化合物保留和抗氧化能力，冻干辣木叶粉被选为后续ZnO-NPs绿色合成的最佳样品。
**3.2 冻干辣木叶提取物的GC–MS表征**
GC–MS分析鉴定出10种主要生物活性成分，占总色谱峰面积的95.80%。其中植醇（phytol，14.87%）为主要成分，其次为亚油酸（12.63%）、β-谷甾醇（11.72%）、角鲨烯（11.25%）、油酸（9.74%）、十六烷酸甲酯（8.52%）、菜油甾醇（8.31%）、豆甾醇（7.85%）、新植二烯（6.24%）和α-生育酚（4.67%）。植醇是一种二萜醇，具有强抗氧化、抗菌和还原能力，是金属纳米颗粒生物合成中的有效还原剂；亚油酸和油酸等不饱和脂肪酸通过吸附于颗粒表面减少聚集而有助于纳米颗粒稳定；β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等甾醇作为天然包覆分子进一步改善纳米颗粒稳定性；角鲨烯和α-生育酚的存在增强了抗氧化能力。这些发现表明冷冻干燥有效保留了多种能够参与Zn2?络合、成核及后续ZnO纳米颗粒稳定的生物活性代谢物。尽管水提在80–90°C进行6 h可能导致维生素C和某些酚类化合物等热敏性植物化学物的部分降解，但GC–MS和HPLC分析证实提取物中仍保留足够的生物活性成分以有效介导ZnO纳米颗粒的还原和稳定。
**3.3 酚类与黄酮类化合物的HPLC定量**
HPLC分析证实冻干辣木叶提取物中存在多种主要酚酸和黄酮类化合物，总定量浓度为70.17 mg/g DW。其中芦丁（rutin，12.64 mg/g DW）为最丰富的黄酮类，其次为槲皮素（10.83 mg/g DW）、儿茶素（9.76 mg/g DW）、绿原酸（8.92 mg/g DW）、山奈酚（7.25 mg/g DW）、咖啡酸（5.37 mg/g DW）、表儿茶素（4.42 mg/g DW）、没食子酸（4.18 mg/g DW）、阿魏酸（3.84 mg/g DW）和对香豆酸（2.96 mg/g DW）。这些酚类化合物是众所周知的电子供体，积极参与锌离子络合并促进其水解和成核为ZnO纳米颗粒，同时作为表面包覆剂。HPLC定量的总浓度（70.17 mg/g DW）明显低于总酚和总黄酮合计值（130.78 mg/g），这是因为Folin–Ciocalteu（TPC）和氯化铝（TFC）比色法测定粗提物对相应试剂的总还原/络合能力，涵盖所有反应性酚类和黄酮类结构，而HPLC仅定量本研究选定的10种标准品，两组数据应视为互补而非直接相加。
**3.4 ZnO-NPs的UV–Vis光谱**
UV–Vis表征显示吸收曲线在365 nm处有明显峰值，表明在紫外区有强吸收，能带隙（E）测得约为3.40 eV。相对较高的带隙能证明ZnO纳米颗粒的有效形成。该峰较典型块体ZnO吸收边（约376 nm）发生蓝移，颗粒尺寸减小导致带隙能增加，这是由于电子和空穴能态之间的空间分离所致。当颗粒尺寸接近玻尔激子半径时，载流子运动受到限制，产生离散能级并增强光学性能。
**3.5 ZnO-NPs的FT-IR分析**
FT-IR分析发现多个明显吸收峰，证明无机和有机基团的功能性。3263 cm?1处的宽峰显示羟基的O–H伸缩振动，常与ZnO纳米颗粒表面结合的OH基团相关；2715 cm?1处峰归因于C–H振动；1689 cm?1处谱带归因于C=O伸缩，提示含羰基官能团作为纳米颗粒生产中的包覆和稳定剂；1504 cm?1处强吸收带归因于芳环内C=C伸缩振动，进一步证明植物提取物中多酚类化学物参与纳米颗粒稳定；1357 cm?1处峰可能对应C–H弯曲振动。重要的是，493 cm?1处特征峰归因于Zn–O伸缩振动，证实ZnO纳米颗粒的成功形成。
**3.6 ZnO-NPs的SEM分析**
SEM分析显示合成ZnO-NPs具有花状形貌，颗粒适度聚集但可区分，植物提取物的使用促进了自组装过程，导致颗粒分布均匀且团聚极少，颗粒尺寸范围为45–82 nm。显微图中空隙和一致颗粒分布表明合成材料具有良好的分散性和稳定性。EDS谱图显示平均元素组成百分比；本研究EDS定量仅对Zn和O信号归一化，排除了源自表面吸附植物化学物包覆层的微量碳信号，因此报告值（72.7% Zn，27.3% O）反映无机ZnO骨架而非纳米颗粒表面的完整元素组成。常规EDS定量对碳、氢等轻元素固有灵敏度较低，且样品处理和导电涂层引入的外来碳污染会进一步干扰碳定量。植物化学物包覆层的独立证据由FT-IR在1689 cm?1（C=O伸缩）和1504 cm?1（芳香C=C伸缩）处的谱带以及zeta电位（?32 mV）提供。
**3.7 ZnO纳米颗粒的粒径分布**
DLS分析显示纳米颗粒呈窄的单峰粒径分布，主峰约位于67 nm，表明纳米颗粒形成相对均匀且聚集极少。无多峰表明绿色合成过程产生了均一的纳米颗粒群体，无显著大团聚体形成。DLS所得平均流体动力学直径与SEM观察（45–82 nm）吻合良好。DLS测得粒径略大于SEM属预期现象，因为DLS测定悬浮液中颗粒的流体动力学直径，包括水化层和吸附的植物化学物包覆分子，而SEM测定干燥纳米颗粒的物理直径。
**3.8 Zeta电位分析**
Zeta电位分析显示纳米颗粒主要zeta电位值约集中于?32 mV。负表面电荷表明源自辣木叶提取物的带负电植物化学物成功吸附于纳米颗粒表面，这些植物化学分子（尤其是酚类和黄酮类）作为天然包覆剂产生静电排斥力，减少纳米颗粒聚集。绝对值大于30 mV的zeta电位通常表明良好的胶体稳定性。该观察结果与贮藏稳定性结果一致，即在60天贮藏期内UV–Vis吸收光谱和抗氧化活性仅观察到可忽略的变化。
**3.9 ZnO纳米颗粒的XRD分析**
XRD图谱显示多个明确定义的衍射峰，对应六方纤锌矿（wurtzite）ZnO晶体结构的特征反射，证实绿色合成过程中氧化锌的成功结晶。尖锐而强烈的衍射峰表明合成纳米颗粒的高结晶度，无宽泛非晶晕表明纳米颗粒具有良好有序的晶体排列。未检测到对应氢氧化锌或其他杂质相的额外衍射峰，提示生物合成纳米颗粒具有高相纯度。高结晶度预期有助于纳米颗粒优异的抗菌和抗氧化活性，因为结晶ZnO具有增强的电子传递特性、增加的活性氧（ROS）生成和改善的表面反应性。
**3.10 ZnO-NPs的抗菌测定**
比较评价了冻干辣木叶提取物、生物合成ZnO-NPs、分析纯ZnO和头孢泊肟（cefpodoxime）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性。辣木提取物表现出可测量的抗菌活性，证实酚类和黄酮类等植物化学物具有内在抗菌特性，但其抑菌圈显著低于200 μg/mL生物合成ZnO-NPs（p<0.05）。分析纯ZnO显示可忽略或无抑菌作用，而绿色合成ZnO-NPs表现出最强的抗菌活性，表明ZnO核心与植物化学物包覆分子之间存在协同作用。ZnO-NPs显示浓度依赖性抗菌活性：在50 μg/mL时，头孢泊肟对所有三种菌产生的抑菌圈显著大于ZnO-NPs；在100 μg/mL时，ZnO-NPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈大于头孢泊肟，而头孢泊肟对枯草芽孢杆菌略大；在最高浓度200 μg/mL时，ZnO-NPs对所有三种病原体产生的抑菌圈显著大于头孢泊肟，平均抑菌圈值分别为大肠杆菌22.75 mm、金黄色葡萄球菌25.25 mm、枯草芽孢杆菌19.75 mm，而头孢泊肟分别为19.25、17.75和18.25 mm（p<0.05）。这些结果表明生物合成ZnO-NPs的抗菌效力呈浓度依赖性，在50 μg/mL时需高于标准抗生素的剂量，但在200 μg/mL时显著优于头孢泊肟。
**3.11 ZnO-NPs的抗氧化效力**
冻干辣木提取物表现出显著的抗氧化和中等抗菌活性，但生物合成ZnO-NPs表现出显著高于单独提取物的DPPH清除活性和抗菌效力，表明纳米颗粒形成增强了超出单独植物化学物的生物学性能。ZnO-NPs的DPPH清除活性呈明显的浓度和时间依赖性增加，在100 μg/mL浓度下，ZnO-NPs在40 min内实现几乎完全的DPPH自由基清除（约99.9%），活性在60 min内保持稳定；即使在较低浓度（10–50 μg/mL）下，纳米颗粒在60 min后也显示超过65%的显著清除率。生物合成ZnO-NPs在所有测试浓度下均表现出显著更高的自由基清除效率（p<0.05），而分析纯ZnO活性最低。生物合成ZnO-NPs增强的抗氧化活性表明纳米颗粒形成不仅保留了植物提取物的抗氧化能力，而且进一步增强。在绿色合成过程中，酚类、黄酮类和其他还原性化合物吸附于纳米颗粒表面作为稳定和包覆剂，这些表面结合的植物化学物提高电子传递效率，而纳米级ZnO为自由基相互作用提供大的反应表面积，因此优越的抗氧化性能源于ZnO核心与植物化学物功能化的协同效应而非任一单独组分。仅提取物对照的纳入验证了本研究关于植物化学物包覆增强绿色合成ZnO纳米颗粒生物学活性的核心假设。
**3.12 绿色合成ZnO-NPs的贮藏稳定性**
在环境黑暗条件下60天贮藏期内，UV–Vis吸收光谱显示初始在365 nm处的特征吸收峰几乎保持不变，60天后记录到从365至363 nm的极轻微蓝移，表明颗粒尺寸或表面状态变化极小。计算的带隙能从第0天的3.40 eV至60天后的3.42 eV仅边际变化，表明纳米颗粒电子性质在贮藏期间大体稳定。可忽略的光谱位移表明源自辣木叶提取物的植物化学物有效作为包覆和稳定剂，防止贮藏期间团聚和氧化降解。抗氧化活性表现出高保留率，100 μg/mL浓度下DPPH自由基清除效率从第0天的99.90%略降至60天后的95.82%，对应约95.9%的活性保留。逐渐降低可能归因于轻微表面重排或松散结合植物化学物分子的部分解吸，但降低无统计学显著性（p>0.05），表明优异的贮藏稳定性。然而，在实际应用前仍需进一步安全性评价，包括细胞毒性和生物相容性研究。
**3.13 DPPH自由基清除行为的动力学分析**
采用准一级动力学模型分析时间依赖性DPPH自由基清除数据，在60 min内监测517 nm处DPPH吸光度降低，ln(A
t/A
0)对时间的线性化图显示强线性相关（R2>0.95），证实自由基清除反应对DPPH浓度遵循准一级动力学。在100 μg/mL浓度下，生物合成纳米颗粒的表观速率常数（k）为0.082 min?1，显著高于分析纯ZnO（0.019 min?1）；相应地，绿色ZnO-NPs存在下DPPH自由基的半衰期（t
1/2）为8.45±0.31 min，显著短于分析纯ZnO（36.48±1.12 min）。这些结果表明植物化学合成的纳米颗粒具有显著更快的电子传递动力学和优越的自由基淬灭效率。绿色合成ZnO-NPs增强的动力学行为可归因于几个协同因素：首先，纳米级粒径（45–82 nm）提供高表面积–体积比，促进纳米颗粒与DPPH分子之间相互作用增加；其次，源自辣木叶提取物的表面结合植物化学物（尤其是酚类和黄酮类）直接贡献电子捐赠和自由基稳定。相比之下，分析纯ZnO表现出相当慢的反应动力学，反映缺乏有机表面功能化和有限的内在电子捐赠能力。总体而言，动力学建模结果验证生物合成ZnO-NPs的抗氧化作用受准一级反应动力学支配，其特征在于快速、浓度依赖的自由基清除。
**四、讨论与结论**
本研究讨论部分指出，ZnO-NPs增强的抗氧化活性表明纳米颗粒形成不仅保留而且进一步增强植物提取物的抗氧化能力，其优越性能源于ZnO核心与植物化学物功能化的协同效应，表面结合的植物化学物提高电子传递效率，而纳米级ZnO提供大的反应表面积。对于动力学差异，分析纯ZnO因缺乏有机表面功能化和有限内在电子捐赠能力而反应动力学较慢，其抗氧化活性主要依赖表面缺陷和内在半导体性质。贮藏稳定性方面，可忽略的光谱位移表明辣木植物化学物有效作为包覆和稳定剂，防止团聚和氧化降解。研究同时指出，提取条件在高效植物化学物回收与成功纳米颗粒合成之间提供了适当平衡，且两组数据（分光光度法与HPLC）应视为互补而非直接相加。
结论部分译文：本研究表明，干燥方式显著影响辣木叶的植物化学组成。冷冻干燥保留了最高水平的酚类、黄酮类、维生素C和β-胡萝卜素，使其成为后续纳米颗粒合成最合适的预处理方式；因此四种干燥方式仅在植物化学物保留阶段进行比较，ZnO纳米颗粒仅由选定的冻干提取物合成和表征，而非由所有四种干燥处理合成。所得ZnO纳米颗粒被成功合成并通过UV–Vis、FT-IR、XRD、SEM、EDS、动态光散射和zeta电位分析全面表征，证实其晶体结构、花状形貌、纳米级尺寸（45–82 nm）和优异的胶体稳定性。与分析纯ZnO相比，生物合成纳米颗粒表现出优越的抗菌和抗氧化活性、更快的准一级自由基清除动力学以及60天内优异的贮藏稳定性，突显了植物化学物包覆的协同作用。这些发现确立了冷冻干燥作为一种通过生态友好合成途径生产稳定且具有生物活性ZnO纳米颗粒的有效预处理方式。未来研究应调查细胞毒性、生物相容性和体内功效，以促进其在食品、制药和生物医学领域的安全应用。
