膳食亮氨酸限制通过减弱mTOR信号抑制血小板驱动的肝细胞癌生长

《Cancer Science》：Dietary Leucine Restriction Suppresses Platelet-Driven HCC Growth by Attenuating mTOR Signaling

　　

血小板在调控肿瘤进展中发挥关键作用，但血小板诱导肝细胞癌（HCC）代谢重编程的机制尚未完全阐明。本研究通过代谢组学分析发现，HCC细胞经血小板孵育后亮氨酸显著蓄积。在完全培养基中与血小板共培养可促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭，而共培养培养基中去除亮氨酸则减弱上述恶性行为。机制上，血小板选择性刺激S6K1及其下游S6的磷酸化，该激活在亮氨酸缺乏条件下被抑制。此外，使用PF-4708671药理学抑制S6K1活性可降低血小板促进的细胞增殖、迁移和侵袭，证实S6K1/S6轴是该反应的重要功能效应器。在体内，饮食亮氨酸限制可减少MHCC-97H异种移植模型中血小板预孵育后的肿瘤生长。综上，这些发现表明亮氨酸蓄积及随后的S6K1/S6激活介导血小板促进的HCC进展，提示靶向亮氨酸可利用性或S6K1信号可能为血小板相关HCC提供治疗策略。

**研究背景与问题提出**

肝癌居全球癌症死亡第三位，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是主要组织学亚型（占75%–85%）。肿瘤恶性进展依赖代谢重编程以满足增殖、分化及微环境适应的生物能量需求，涉及葡萄糖、脂肪酸和氨基酸的广泛利用。已有证据表明HCC中亮氨酸蓄积可通过持续激活mTOR信号驱动肿瘤进展，支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）调控可影响体外增殖能力与体内肿瘤负荷，膳食BCAA摄入与癌症死亡风险显著相关；研究人员前期工作亦阐明BCAA与脂肪酸蓄积通过诱导T细胞耗竭协同促进肿瘤生长。血小板作为骨髓巨核细胞来源的无核胞质碎片，其膜受体、颗粒、细胞因子和代谢物等生物活性成分使其成为肿瘤进展的关键介质，可刺激肿瘤细胞增殖、抵抗失巢凋亡并促进转移；癌细胞还可获取血小板功能性线粒体以增强能量代谢与转移潜能。研究人员此前报道结直肠癌患者肿瘤相关富血小板血浆中TCA循环代谢物上调，HCC患者血小板蛋白质组中BCAA分解代谢关键酶及线粒体氧化磷酸化显著上调，靶向代谢组学亦显示富血小板血浆中延胡索酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸和琥珀酸等多种TCA循环中间产物蓄积。然而，血小板来源的代谢重编程如何影响HCC进展仍知之甚少，故本研究旨在系统验证氨基酸可利用性在介导血小板增强HCC进展中的功能意义。

**主要关键技术方法**

研究人员采用LC–MS/MS（liquid chromatography–tandem mass spectrometry）靶向代谢组学（MRM模式，MetWare平台）分析血小板共培养后HCC细胞代谢谱，并以OPLS-DA、火山图及HMDP/KEGG通路富集解析差异代谢物；建立无亮氨酸培养基共培养体系（血小板与细胞比1000:1，24 h），以EdU掺入和Transwell实验评价增殖、迁移与侵袭；以Western blotting检测mTOR、S6K1、S6、4EBP1及其磷酸化水平，并用S6K1抑制剂PF-4708671进行药理学拯救实验；体内采用雄性BALB/c小鼠（4–8周龄）喂饲亮氨酸缺乏饲料4周后皮下接种血小板预孵育的MHCC-97H细胞，监测肿瘤生长并结合Ki-67免疫组化及血浆氨基酸靶向代谢组学验证。人外周血血小板来自健康成年供者（广西医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，批号2025-E0092）。

**研究结果**

3.1 血小板处理诱导HCC细胞代谢重编程。对血小板共培养后的MHCC-97H细胞行LC–MS/MS靶向代谢组学，共定量59种代谢物；OPLS-DA显示处理组与未处理组代谢聚类明显分离，15种代谢物显著上调，氨基酸（谷氨酰胺、亮氨酸）及TCA循环相关中间产物（天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酰辅酶A）明显升高，HMDP显示Warburg效应、尿素循环、谷氨酸代谢及缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解等通路改变。Huh7细胞中亦见代谢分离，9种上调、1种下调，差异代谢物以氨基酸（丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸）为主，尿素循环与天冬氨酸代谢显著激活。整合KEGG与HMDP构建的代谢相关网络识别出磷酸戊糖途径、核苷酸合成、TCA循环、嘌呤核苷酸循环和尿素循环五条显著受影响通路，两株细胞中亮氨酸与谷氨酰胺相对对照均显著蓄积。

3.2 亮氨酸剥夺减弱血小板介导的HCC细胞增殖、迁移和侵袭增强。EdU定量显示，单纯无亮氨酸培养使基础增殖中度降低；完全培养基中血小板共培养显著提高MHCC-97H和Huh7增殖活性，无亮氨酸培养基则减弱此促进作用。Transwell实验显示短期亮氨酸剥夺对基础迁移和侵袭能力影响可忽略，而完全培养基中共培养血小板显著增强迁移与侵袭，该效应在无亮氨酸条件下被大幅抑制。

3.3 亮氨酸剥夺减弱血小板诱导的HCC细胞mTOR通路激活。短期亮氨酸剥夺对基础mTORC1通路活性影响可忽略；血小板刺激未改变mTOR与4EBP1磷酸化水平，但两株细胞中S6K1（Thr389/Thr412）与S6（Ser235/236）磷酸化显著升高，亮氨酸剥夺减弱该激活，提示亮氨酸可利用性选择性调节血小板诱导的mTOR通路组分活化。

3.4 S6K1抑制剂减弱血小板诱导的恶性表型及S6磷酸化。PF-4708671在MHCC-97H与Huh7中的IC₅₀分别为59.25 μM与58.73 μM，后续采用半IC₅₀的亚细胞毒性浓度。血小板共培养促进增殖、迁移、侵袭并触发下游S6磷酸化；PF-4708671抑制上述恶性表型，并阻断血小板诱导的S6磷酸化，而对上游mTOR或平行通路4EBP1磷酸化影响可忽略。

3.5 饮食亮氨酸限制减弱体内血小板促进的HCC肿瘤生长。小鼠接受对照或亮氨酸缺乏饲料4周后植入经血小板预孵育的MHCC-97H皮下移植瘤；血小板共培养显著增强移植瘤生长，亮氨酸缺乏有效减弱此促进作用，瘤重亦降低。血浆靶向代谢组学证实亮氨酸缺乏组循环亮氨酸显著下降，而异亮氨酸与缬氨酸水平两组相当。免疫组化显示血小板处理组Ki-67阳性增强，亮氨酸限制组Ki-67增殖指数显著降低。

**讨论与结论**

讨论指出，血小板经线粒体转移和细胞外囊泡分泌驱动癌细胞代谢适应，可增强乳腺癌细胞ATP产生、氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）及代谢适应性，并激活间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）TCA循环；HCC中谷氨酰胺与亮氨酸代谢尤为关键，谷氨酰胺限制可破坏GPR109A⁺髓系细胞免疫抑制功能，同时抑制谷氨酰胺与BCAA代谢可抑制HCC生长，二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase，DLAT）基因敲除降低细胞内亮氨酸、抑制mTOR信号并限制HCC增殖。血小板在肿瘤生长中的作用文献中存在争议，本研究证实血小板显著增强两株HCC细胞增殖、迁移和侵袭，亮氨酸剥夺则显著抑制之。关于亮氨酸作用亦存在分歧：Chen等报道亮氨酸剥夺抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，Hassan等则发现亮氨酸补充呈剂量依赖性抗增殖效应而剥夺不影响细胞活力；本研究提供亮氨酸剥夺有效减弱血小板诱导恶性行为的证据。mTORC1主要通过磷酸化S6K1与4EBP1调控核糖体生物合成、蛋白合成与细胞生长，血小板共培养与亮氨酸剥夺选择性调节S6K1和S6磷酸化而mTOR与4EBP1磷酸化基本不变，此选择性与mTORC1通路底物敏感性层级一致——S6K1对亮氨酸可利用性波动敏感，而4EBP1磷酸化被保留以支持基础翻译；mTOR磷酸化主要受上游PI3K/Akt信号调控而非氨基酸充足性的直接指标。研究亦指出局限性：需稳定同位素示踪明确血小板直接释放与细胞转运改变的相对贡献，需剂量依赖性L-亮氨酸滴定确定阈值，体内实验仅用MHCC-97H异种移植模型（Huh7在免疫缺陷小鼠中成瘤性低），需患者来源异种移植或免疫健全模型及系统性血小板清除或重复输注实验进一步验证。研究结论为：数据表明亮氨酸在介导血小板促HCC细胞增殖、迁移和侵袭中起关键作用；亮氨酸剥夺抑制血小板诱导的S6K1/S6信号通路激活；PF-4708671药理学抑制S6K1可抑制血小板诱导的增殖、迁移和侵袭并阻断下游S6磷酸化；这些结果确立亮氨酸-S6K1-S6信号轴为血小板刺激HCC进展的功能性介质，凸显膳食亮氨酸调控与S6K1抑制作为对抗血小板相关恶性肿瘤的潜在治疗途径。