**一种用于细胞外蛋白内化的高效溶酶体靶向肽配体的开发**

《ChemBioChem》：Development of Highly Efficient Lysosome-Targeting Peptide Ligands for the Internalization of Extracellular Proteins

　　

溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）通过内源性受体，如胰岛素样生长因子-2受体（IGF2R），亦称为阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体，将细胞外蛋白和膜相关蛋白转运至溶酶体，从而诱导其内化。尽管现有的IGF2R配体有效，但拓展LYTAC工具箱、开发结构简单且易于合成的配体仍具有实际必要性。本研究首先验证了既往报道的二聚体和单体肽可诱导稳健的内化，确立其为有效的IGF2R靶向LYTAC配体。为进一步优化肽结构，研究人员对其单体序列进行了系统性突变扫描以简化肽结构。研究人员鉴定出L4变体，其特征为第四位点的单个亮氨酸替换。该优化单体诱导的内化效率高于既往报道的野生型单体肽配体。为证明其应用价值，研究人员将L4招募子与特异性PCSK9结合子偶联。所得双功能分子成功诱导了PCSK9的剂量依赖性和时间依赖性内化。总体而言，这些发现确立了若干肽变体作为开发细胞外蛋白内化平台的实用且高效的构建模块。

**研究背景与问题** 靶向蛋白降解（TPD）是一种主动降解致病蛋白而非仅抑制其功能的治疗策略。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）通过泛素-蛋白酶体系统有效降解细胞内靶点，但通常局限于具有可及胞内结构域的蛋白。由于细胞外蛋白和膜相关蛋白构成治疗靶点的重要部分，亟需替代策略。为此，研究人员开发了溶酶体靶向嵌合体（LYTACs），其招募内源性内体-溶酶体受体将细胞外靶点转运至溶酶体降解。胰岛素样生长因子-2受体（IGF2R），亦称阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR），广泛用于LYTAC介导的降解。现有IGF2R招募配体主要包括基于甘露糖-6-磷酸（M6P）的聚合物、工程化IGF-2蛋白及IGF-2肽模拟物。以结构简单、易于合成的肽拓展IGF2R基LYTAC工具箱，可为构建新型降解剂提供实用构件，这是开展本研究的动因。

**研究内容与结论** 研究人员从既往报道的IGF2R结合肽431出发，评估其单体和二聚体诱导大分子模型货物（NeutrAvidin-650）内化的能力，两者均诱导显著货物内化；并验证二聚体肽有效将货物转运至溶酶体，确认野生型肽本身即为IGF2R基LYTAC的有效构件。为简化分子结构同时保持高递送效率，研究人员对单体序列进行系统性单位点突变扫描，鉴定出L4变体（肽10），即第四位点单个亮氨酸替换，其诱导货物内化的能力显著优于野生型单体肽2。随后将L4招募子与PCSK9结合子偶联，确认所得双功能分子成功诱导PCSK9的剂量依赖性和时间依赖性内化。该结构简单的L4变体成为未来TPD的高效稳健肽平台。其重要意义在于为细胞外蛋白内化平台提供了结构简单、合成可及且高效的构建模块。

**关键技术方法** 研究采用固相肽合成制备生物素化肽变体库（含单体、二聚体及突变扫描库）；以NeutrAvidin-650为模型货物，在HepG2、Huh7及U87细胞系中通过流式细胞术和微板读数仪荧光定量评估内化效率；采用蛋白质印迹（Western Blot）检测货物内化及IGF2R水平；以共聚焦显微镜结合LysoTracker共染分析溶酶体共定位；通过sgRNA介导构建IGF2R稳定敲低（KD）Huh7细胞系并以流式细胞术验证表面受体下调；并合成L4招募子与PCSK9抑制剂AZD0780偶联的双功能分子进行靶向内化评价。样本队列来源为上述商业细胞系，无临床样本队列。

**研究结果** 2.1 IGF2R招募肽的设计与筛选：通过比较N端（肽1）与C端（肽2）经AEEA连接子生物素化，发现肽2内化显著更高，表明C端修饰更好保留431基序功能；经AEEA间隔子连接的二聚体肽3驱动货物摄取显著高于单体肽2，故选肽3为二聚体基准。2.2 二聚体招募子的结构评价：结构-活性关系（SAR）研究表明去除C端丝氨酸（肽4）不显著损害摄取；连接子长度（0、1、2、4个AEEA单元，肽5、3、6、7）无显著差异；引入赖氨酸-赖氨酸（肽8）或精氨酸-精氨酸（肽9）基序在500 nM下仅边际增加荧光，为避免过量正电荷的非特异膜相互作用未继续该修饰， reaffirm肽3为稳健功能性二聚体基线。2.3 431二聚体介导货物内化与溶酶体转运的表征：时间进程实验显示24 h内NA-650时间依赖性蓄积；Western Blot显示剂量依赖性增加并于约0.63 μM达平台；IGF2R总水平未见降解；1000 nM肽3使培养基中货物清除约80%；共聚焦显示内化NA-650与溶酶体共定位呈黄色斑点；洗脱实验显示胞内货物信号随时间渐进减少，支持内化后清除；IGF2R KD细胞表面受体降低约40%，货物荧光信号相应降低约50%，证实肽3介导的货物递送依赖IGF2R通路。2.4 肽3与其他已知IGF2R配体的比较：肽3在1 μM时的胞内信号强于10 μM的M6Pn-生物素，同浓度下货物摄取高于野生型IGF-2蛋白，确认其为高效IGF2R招募子。2.5 单体431肽的突变扫描：基于12氨基酸序列构建突变库，第2至12位各替换为8种代表性氨基酸，第1位含4个野生型重复及4种特定替换；在Huh7和U87细胞中测定NA-650摄取，热图显示两细胞系活性模式一致；第四位替换为亮氨酸（L4突变）在两种细胞中内化效率最高，第7和10位替换为精氨酸等碱性氨基酸略有改善，但L4为最强单一修饰，故选为后续双功能分子设计的先导序列。2.6 优化L4单体与既往表征肽的货物摄取比较：L4单体（肽10）呈剂量依赖性增加货物摄取，500 nM时达最大效率；该浓度下较野生型单体（肽2）提高三至四倍，虽低于二价肽3，但显著缩小性能差距，在分子简单性与功能效力间取得有利平衡；随机序列对照肽11仅诱导边际内化，确认增强由特定序列驱动；IGF2R KD下肽10介导的货物摄取未受可检测影响，但KD细胞IGF2R仅部分降低，数据不能排除肽10高效利用残余IGF2R池的可能，其精确受体依赖性尚待确立。2.7 基于L4的双功能分子靶向内化PCSK9：选择心血管疾病靶点前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型（PCSK9），其促进LDLR溶酶体降解而抑制低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）血浆清除；将L4招募子与AZD0780偶联构建双功能分子，处理细胞后呈剂量依赖性PCSK9内化，时间进程实验证实胞内PCSK9时间依赖性蓄积，表明L4招募子可成功驱动内源性疾病相关蛋白的摄取。

**讨论与结论** 讨论指出，随机序列对照肽证实L4增强摄取具序列特异性；IGF2R KD研究显示L4介导内化较亲本肽对部分IGF2R耗竭不敏感，但因KD后仍有大量残余IGF2R，数据无法区分对残余IGF2R池的高效利用与额外摄取通路的可能贡献，故需完全IGF2R敲除模型及无偏遗传筛选以明确L4增强活性所依赖的受体与内吞机制；未来研究将把L4平台拓展至其他治疗相关细胞外及膜相关蛋白，并进一步优化靶标结合部分、连接子结构、招募子价态及整体分子构型以提升内化效率并拓宽该肽基LYTAC平台的应用范围。研究结论为：本研究首先评估既往报道的IGF2R结合肽431，验证其单体和二聚体形式均具稳健货物内化能力；除货物内化外还考察了被招募蛋白内化后的命运，双功能分子洗脱后胞内货物信号（NA-650）随时间渐进减少，表明其后续被胞内清除而非稳定蓄积，结合以NeutrAvidin为模型货物的溶酶体共定位研究，支持优化肽支架促进货物摄取与溶酶体转运的能力；并明确证实二价二聚体诱导的IGF2R依赖性内化，确立野生型肽支架为IGF2R靶向LYTAC的有效功能性基线。在此基础上优化单体序列以简化招募子结构，通过突变筛选鉴定出第四位点单个亮氨酸替换的L4变体（肽10），其内吞活性较野生型支架大幅提高，虽略低于二价二聚体，但实现了稳健高效的内化。最后将L4招募子与PCSK9结合子偶联构建双功能分子，成功诱导PCSK9的剂量依赖性和时间依赖性内化，证明优化招募子可整合入靶标特异性双功能架构。