## 1. 专业标题 **基于密度泛函模拟的固氮酶D2双重加氢生成2HD的新机制：H原子供体画廊的反应轨迹探索与实验数据验证**

《ChemBioChem》：Explorations of the Hydrogenation of D2 by Nitrogenase

　　

## 3. 摘要翻译

酶固氮酶（nitrogenase）的一种非生理性底物D₂被该酶双重加氢，生成2HD。这一“HD反应”与酶的天然功能——将N₂加氢生成NH₃——相互竞争。在酶的活性中心，研究人员鉴定出一个H原子供体画廊（gallery of H atom donors），所提出的N₂反应完整循环机制利用这些供体八次，以生成2NH₃+H₂产物。本研究中，研究人员考察了这些H原子供体在将D₂加氢生成2HD过程中的功能，采用密度泛函（density functional）模拟，作用于包含所有重要周围环境、原子数超过480个的活性中心模型。研究人员探索了众多可能的反应轨迹，并提出了修正后的HD反应机制。D₂加氢机制与N₂加氢机制具有共同组分，这解释了二者在实验上已知的竞争关系。研究人员考察了关于HD反应的十项相关实验数据，表明所提出的机制如何符合并解释这些数据，尽管仍有两项实验观察尚待验证。

## 4. 论文解读

### 研究背景与问题

固氮酶（nitrogenase）是能将惰性的大气氮转化为生物可用氨的酶，可在温和条件下活化并加氢极为惰性的N₂分子，这是人类工业至今尚未实现的。该酶在结构上已被充分认识，但中间体的分离与表征困难，化学机制在实验上仍难以阐明。按化学计量式推断，其机制循环至少包含27个化学步骤：八次质子引入、八次电子添加、N₂结合、N─N键断裂、六个N─H键形成、两次NH₃解离以及一个H─H键形成。Mo-固氮酶的活性中心是组成为Fe₇MoS₉C（高柠檬酸，homocitrate）的FeMo-co簇。

1960年发现，含固氮酶的大豆根瘤在D₂/N₂气氛下生成HD，即“HD反应”（D₂+2H⁺+2e^–→2HD）。该反应并非固氮酶的天然功能，但要求N₂存在，并与N₂→NH₃转化竞争，因此理解HD反应有助于理解生理反应的机制。作者此前曾用密度泛函模拟提出一个HD反应机制：D₂结合于endo-Fe6位点后发生放能的协同双重加氢，生成两个分别配位于endo-Fe2和exo-Fe6的HD分子，随后依次解离。而exo-Fe2位的N₂处于无H原子供体区域，被称为“不可还原”N₂。在N₂→2NH₃机制中，关键的N₂捕获步骤同样是协同双重加氢，由S2B上的H与endo-Fe7上的H完成。由于H供体画廊提供了多种可能，作者因而探究：D₂能否像N₂捕获那样由S2BH与7Hn加氢？由此检验其他可能的D₂加氢途径。

### 主要技术方法

研究采用作者建立的480+原子活性中心及全部相关周围环境模型，以DMol3密度泛函方法模拟反应轨迹，计算各中间体与过渡态的电子态、自旋密度与能量；FeMo-co电子态设定为“235”，自旋密度在Fe2、Fe3、Fe5上取负值，其依据见支持信息；结果模型含H而不含D，未计入零点振动能。样本为文献报道的十项HD反应实验数据和PDB 3U7Q（*Azotobacter vinelandii*）晶体结构，无试剂与培养操作。

### 研究结果

**4.1 反应序列**：计算序列始于E4阶段结合于endo-Fe6的H₂（6H₂n，7），其为H₂/N₂交换的前体；此中间体处于加入4个电子、5个质子之后。平行构象7无势垒旋转为横向构象8，8经6Hx与7Hn协同双重加氢生成10，反应能?14 kcal mol^?1、势垒8 kcal mol^?1；无exo-Fe2位不可还原N₂时（8x→10x）为?16与10 kcal mol^?1。替代路径为Fe6的endo/exo间放能D原子交换生成9，再由7Hn捕获6Dn生成7DHn。10中两个HD分别配位于exo-Fe6与endo-Fe7，二者解离均放能，7H₂n解离势垒仅2 kcal mol^?1。涉及S2BH的两种加氢均吸能且势垒高达23与26 kcal mol^?1，S2B-H的桥连几何使H─H形成轨迹困难。S2BH+6Hx组合不能使endo-Fe6的D₂双重加氢，因Fe6的endo/exo间H与H₂交换占主导（14→15，与8→9类似）。

**4.2 几何构型**：关键特征是Fe6与中心C原子（Cc）距离的可变伸长：8→10中由2.40 ?经过渡态2.52 ?至产物2.83 ?，与Fe6配位程度和立体化学相关；H₂从exo-Fe6解离时Cc─Fe6由2.88 ?剧变至1.96 ?，从endo-Fe7解离则变化很小；从endo-Fe6解离时包角由161°降至141°。Fe6在配位数4、5、6间变化时保持对称配位立体化学；总能包含几何适应能与键断裂/形成能。由此归纳出反应性原理：S2B─H键在形成H─H时难以断裂；7Hn能有效从邻近H₂夺取H原子；exo-Fe6位生成H₂（6H₂x）有强稳定化作用，是10较13能量优势的主要来源。

**4.3 Exo-Fe6-N₂**：鉴于CO可结合于exo-Fe6而CO与N₂扩散相似，N₂可能进入并占据该位；exo-Fe6-N₂远离加氢腔，不太可能转化为NH₃，但可影响腔内H₂反应性。模拟追踪第二个N₂经入口通道、越过2N2x进入反应空间并趋向exo-Fe6的扩散，沿途能量变化小于5 kcal mol^?1，中部位点N₂挤过S3B与Val70甲基之间，与Val70被更大异亮氨酸取代后CO结合受抑而不显著改变的实验结果一致；Arg96与Gly69、Val70羰基间的氢键形成“冠盖”。Fe6-N₂结合弱于Fe2-N₂，N₂解离的熵贡献约?4 kcal mol^?1可抵消势能；exo位结合N₂时Cc─Fe距离变化，H桥连Fe2与Fe6时Cc─Fe6伸长受限。当6N2x存在时，endo-Fe6结合H₂变为吸能（+7 kcal mol^?1），且无势垒与7Hn交换生成更稳定的7H₂n（20，低16 kcal mol^?1），该体系不能以S2BH与7Hn完成D₂→2HD；6N2x对endo-Fe6的去活化归因于其对Fe6配位容量的更大贡献。

### 讨论与结论

讨论确认FeMo-co的可塑性（不破坏结构）、Fe─Cc距离变化、可变包角与配位别构效应，Fe配位保持球对称；H或H₂配位引起的Fe自旋密度变化较含N配体为小。作者提出可行新机制8→10→11与12：放能14 kcal mol^?1、势垒8 kcal mol^?1，随后6H₂x与7H₂n放能解离完成反应。

**对实验的检验**：一，HD反应需要N₂（无N₂时<1%），作者提出2N2x通过占据exo-Fe2阻断D₂结合、把D₂驱入可加氢反应空间而起“使能”作用；二，较高pN₂抑制HD，因可还原N₂与D₂竞争同一空间；三，HD与NH₃的Km(N₂)不同，因二者涉及不同N₂结合功能；四，两反应竞争同一电子，即竞争同一批H原子供体；五，化学计量式在机制中得到体现；六，CO同等抑制两途径，因其形成Fe2─CO─Fe6桥阻断endo位点；七，T₂时几乎无TOH，源于反应域无水疏水环境及质子线不可逆；八，195Gln与195Asn突变体反应性差异，本研究无法解释，仅指出195Gln侧链可与S2B形成扭曲氢键而195Asn不能；九，C₂H₂存在时生成C₂H₃D，可设想C₂H₂结合于11或12的Fe6空位或9d的exo-Fe6后加D与H；十，N₂与HD周转不生成D₂，Scheme 9的循环因仅四分之一取向可行、能量变化小但势垒依次为13、2、10、9、9、12 kcal mol^?1而难以竞争性进行。作者还指出S2BH对H₂转移在能量上不利（H─S断裂与H─H形成能量差及几何不便），而N₂捕获中H─N形成可与H─S断裂更好竞争；N₂捕获势垒计算值26–29 kcal mol^?1高于周转率所允许，作者认为系计算不准确，并提示可能存在未计入的H原子量子隧穿效应。

**结论翻译**：作者得出结论，所提出的HD反应8→10→11和12机制可行且与实验一致。与Scheme 1先前序列的差别在于使用endo-Fe7─H替代endo-Fe2─H；两者均为D₂的协同双重加氢（另一供体为exo-Fe6─H），动力学相似。现机制与使用endo-Fe7─H（而endo-Fe2─H会造成阻碍）的协同N₂捕获步骤更为契合。所有这些提议构成固氮酶作为加氢酶的整体模型的一部分：利用Fe2、Fe6与Fe7之间、由Val70封顶的反应腔周围的H原子供体。作者预期乙炔的加氢（D₂存在下的氘代）也将使用反应腔周围的H（D）原子供体。