## 题目 基于拷贝数变异（CNV）的肩突硬蜱（*Ixodes scapularis*）与微小扇头蜱（*Rhipicephalus microplus*）幼期分子性别鉴定：qPCR与ddPCR方法

《Ecology and Evolution》：Copy Number Variation-Based Molecular Sexing of Ixodes scapularis and Rhipicephalus microplus Immature Stages Using qPCR and ddPCR Approaches

幼期蜱的准确性别鉴定对于理解性别相关的生态动力学（ecological dynamics）、病原体传播及生殖生物学至关重要。然而，蜱的幼虫（larvae）和若虫（nymphs）缺乏形态学性别二态性（sexual dimorphisms），限制了此类研究。本研究报告了针对两种重要硬蜱（hard tick）——肩突硬蜱（*Ixodes scapularis*，人类病原体的主要公共卫生媒介）与微小扇头蜱（*Rhipicephalus microplus*，造成养牛业重大经济损失的外寄生虫）——基于拷贝数变异（copy number variation, CNV）的分子性别鉴定方法的开发与验证。研究人员利用新近发表的染色体水平基因组组装与全基因组重测序（whole-genome resequencing）数据，在两个基因——钙/钙调蛋白依赖性3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶1A样基因（calcium/calmodulin-dependent 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1A-like, NPD）与Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子2样基因（rap guanine nucleotide exchange factor 2-like, RAPGEF2）——中鉴定出雌性富集（female-enriched）的CNV，并开发了基于SYBR-Green与探针法的qPCR及微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）检测方法，所用DNA以非损伤性方式从单条足（single leg）提取，从而保留蜱以继续吸血、蜕皮与行为学分析。在*I. scapularis*中，研究人员依据至少两种分子检测的结果，成功对91.3%的若虫完成性别判定，且这些判定在若虫随后蜕皮为成蜱后得到确认。类似地，在*R. microplus*中，qPCR检测揭示出清晰的、与性别连锁的基因拷贝数差异。综上，这些发现表明基于CNV的标记是一种可靠且广泛适用的幼期蜱性别鉴定方法。

## 论文解读

研究背景方面，莱姆病（Lyme disease, LD）发病率持续上升及其他蜱媒人类疾病不断出现，已成为全球性公共卫生问题。肩突硬蜱（*Ixodes scapularis*）是至少七种人类致病病原体（如伯氏疏螺旋体*Borrelia burgdorferi*，以及*Babesia microti*、*Anaplasma phagocytophilum*等）的主要媒介；微小扇头蜱（*Rhipicephalus microplus*）广泛分布于亚洲、中南美洲及撒哈拉以南非洲的热带与亚热带地区，主要侵袭牛，是*Babesia bovis*、*Babesia bigemina*、*Anaplasma marginale*等兽医病原体的重要媒介，每年造成全球农业数十亿美元损失。蜱媒病原体在自然界的传播主要依赖幼虫和若虫阶段，二者常在同一脊椎动物宿主体上吸血，但雌、雄幼期的具体作用大多未知。现存问题在于：幼期蜱缺乏形态学性别差异，肉眼无法区分；现有性别鉴定方法多具侵入性、需专用设备或仅在蜕皮后方可应用；已发表的蜱分子性别鉴定方法仅针对*I. scapularis*、尚处早期阶段，未被改造成实时荧光定量PCR（qPCR）或微滴式数字PCR（ddPCR）等高灵敏度方法，也未在其他蜱种中检验。另一方面，硬蜱分为两个亚科：前沟亚科（Prostriata，含*Ixodes*属，XX:XY性别决定系统）与后沟亚科（Metastriata，多数物种丢失Y染色体，为XX:XO系统，*R. microplus*即属此类）。这些性别决定差异提示，性连锁基因的CNV可能使检测方法适用于多个物种；类似CNV思路已在科罗拉多马铃薯甲虫（*Leptinotarsa decemlineata*）中实现跨虫态性别鉴定。因此，研究人员旨在基于新近公布的染色体水平基因组组装与重测序数据开发CNV分子性别鉴定方法，并以非损伤性单足取样保留蜱体，从而支撑病原体传播研究和基因防控策略（如CRISPR-Cas9基因驱动、自限性遗传系统、不育雄虫技术）的探索。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员利用公开的PacBio HiFi读长数据（1雄2雌*I. scapularis*）比对参考基因组，以2 kb非重叠窗口计算覆盖度并经常染色体中位覆盖度归一化，以雌雄覆盖度比值鉴定性偏向区域及重叠基因，筛选出NPD与RAPGEF2；以EF-1α为参考基因，设计引物及FAM/HEX标记、ZEN Iowa Black淬灭探针。样本来源：无病原*I. scapularis*若虫与成蜱购自俄克拉荷马州立大学（OSU）蜱饲养设施，在新西兰白兔体上吸血；*R. microplus* La Minita株无病原蜱来自USDA-ARS，于罗斯林研究所（爱丁堡大学）饲养。方法包括常规PCR验证、SYBR Green qPCR、探针法qPCR与ddPCR（Bio-Rad QX200系统），并以已发表的双重PCR（duplex PCR）作比较；成蜱性别经形态学确定作为对照，若虫经吸血蜕皮后进行形态学验证。

研究结果：3.1.1 常规PCR验证性特异性引物与单足DNA提取效率——RAPGEF2、NPD、EF-1α在雌雄成蜱足部gDNA中均扩增出约100–125 bp预期条带、几乎无非特异条带，β-actin扩增显示23份若虫样本DNA质量均合格，证明单足提取方案有效且引物具基因特异性。3.1.2 双重PCR——23份若虫足样中仅9份产生强条带，其中7份显示326 bp雄性特异与406 bp常染色体双条带判为雄性、2份仅406 bp判为雌性；多数条带微弱难判，提高gDNA量又产生非特异条带，促使研究人员转向更灵敏的定量方法。3.1.3 SYBR法qPCR——先用13雄13雌成蜱建立基线：RAPGEF2在雌雄间部分重叠，而NPD分离清晰；据成蜱分布设定相对拷贝数阈值0.97（雄性最大值0.72与雌性最小值1.21的中点），低于0.97判雄、≥0.97判雌；单用该法可对23只若虫中22只（95.6%）作出判定，唯N10相对拷贝数高达7.23、超出验证范围。3.1.4 探针法qPCR——以NPD:EF-1α比值<1.66判雄、≥1.66判雌（取自最高雄1.59与最低雌1.75的中点），23份中20份（87%）获判，其中13份与SYBR结果一致；N1与N10因拷贝数异常高（>5）作为离群值剔除，N22接近阈值判为不确定。3.1.5 ddPCR——初始低gDNA投入变异大，提高gDNA至2.2–4 μL并调整引物探针浓度后优化；以NPD:EF-1α<0.6判雄、≥1.0判雌，23份中17份（74%）获判，其中15份与至少一种qPCR结果一致。3.1.6 分子方法比较与形态学验证——以至少两种方法结果一致为判定标准，23只若虫中21只（91.3%）完成判定（8雄13雌）：4只四种方法完全一致、6只三种方法一致、11只两种方法一致；N10与N22无法确定。3.1.7 形态学验证——23只若虫中20只存活至可吸血（约6周），10只吸血至饱血、7只成功蜕皮；分子预测为雄者5只中4只（80%）蜕为雄成蜱，预测为雌者3只中2只（66.6%）蜕为雌成蜱，一只预测雄虫在蜕皮前死亡；蜕皮后成蜱缺失的足可再生，说明剪足不影响存活与吸血，为分子判定提供初步形态学支持。3.1.8 若虫体重作为性别预测指标——10只饱血若虫体重显示分子判定雌性显著重于雄性（p < 0.0001）；两只未能分子判定的若虫体重落入雌性范围，暂定为雌性，其中一只存活蜕皮后确认了预测性别，支持体重作为辅助指标。3.2.1 *R. microplus*若虫探针法qPCR——设计靶向RAPGEF2与NPD的双探针检测、以EF-1α为参考：成蜱NPD相对拷贝数均值雄性0.99、雌性2.02，RAPGEF2雄性0.81、雌性1.41；若虫检测采用更保守的判定窗口（Ct≥32者剔除，相对拷贝数>0.5且<0.2者剔除，NPD与RAPGEF2均<1判雄、均>1.5判雌，中间值判为不可靠）；201只若虫中6只因高Ct剔除、9只因拷贝数过高或过低剔除，余者78只判雄、42只判雌，66只处中间值无法明确判定；NPD结果呈更明显的双峰分布、成蜱均值差距更大，提示单独NPD检测或已足够可靠。

讨论部分总结：本研究开发了基于雌性富集基因NPD、经SYBR Green qPCR、探针法qPCR与ddPCR检测的*I. scapularis*与*R. microplus*若虫分子性别鉴定方法，仅需单足或部分足等少量组织，无需处死蜱即可判定性别并支持后续监测或验证；据研究人员所知，这是qPCR与ddPCR等高灵敏度分子性别鉴定方法首次应用于任何蜱种的幼期阶段，弥补了蜕皮前无法形态鉴别的关键空白。早期准确性别鉴定有助于理解种群性比及雌雄在寻宿、吸血、病原获得等性状上的差异，也是应用自性化品系等遗传防控策略的前提。既往幼期蜱性别鉴定依赖破坏性解剖、高端显微镜或尚未在qPCR平台验证的遗传标记；研究人员采用Ronai et al.（2025）双重PCR配合单足非损伤DNA提取时条带微弱、结果不确定，增加gDNA量或循环数又产生假条带，故转向更灵敏的技术。qPCR较常规PCR更灵敏、经济、高通量；ddPCR因将模板分配至数千液滴、无需标准曲线即可绝对定量，提供了最精确一致的NPD拷贝数定量，qPCR在低模板浓度时变异较大；SYBR法在若虫分型上优于探针法，但二者灵敏度均不及ddPCR；与*R. microplus*一样使用两个基因可提高qPCR判定信心。饱血若虫体重的性别差异与既往报道一致，两只未能分子判定的样本据体重归为雌性，但仅一只获蜕皮验证。研究局限在于*I. scapularis*验证所依据的成功蜕皮若虫数量较少，难以准确评估分类性能；*R. microplus*约三分之一若虫因未达预设置信阈值而未获判定，此为在判定率与置信度之间的权衡。该工作为开发泛蜱性别鉴定方法奠定基础，且方法在XX:XY与XX:XO系统均有效；*R. microplus*中先前注释为2号与8号染色体上的若干基因拷贝数可变，这与Tidwell et al.（2024）重新核型分析及基因组组装将上述染色体鉴定为X染色体的结果一致。未来应扩大数据集检验方法稳健性、发掘更多基因以构建多重检测，并深入剖析*I. scapularis*性染色体尤其雄性特异区与拟常染色体区以寻找新标记。

结论翻译：本研究所述的非损伤性分子方法可借助雌性富集基因靶标NPD，通过SYBR Green qPCR、探针法qPCR与ddPCR从单条足完成性别鉴定。该方法微创、可扩展，并保留蜱的存活力以用于行为学检测、病原获得/传播研究或种群繁育等下游分析。重要的是，该方法适用于*I. scapularis*与*R. microplus*，显示出其在亲缘关系较远的蜱种间的通用性。通过结合灵敏度、物种适用性与非损伤性取样，该方法为需要在早期生活史阶段进行性别鉴定的发育生物学、生态学与媒介生物学研究提供了有价值的工具。