《Ecology and Evolution》：Preliminary Evidence Suggests the Transcriptomic Response of Tricolored Bats to White-Nose Syndrome Is Similar but Not Identical to That of Little Brown Bats
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了解新发野生动物疾病的病理生理学（pathophysiology）可为治疗提供依据、改善长期种群轨迹预测，并揭示不同物种间种群层面影响的差异。北美冬眠蝙蝠白鼻综合征（white-nose syndrome, WNS）的研究大多集中于单一高度易感物种——褐蝠（M
了解新发野生动物疾病的病理生理学（pathophysiology）可为治疗提供依据、改善长期种群轨迹预测，并揭示不同物种间种群层面影响的差异。北美冬眠蝙蝠白鼻综合征（white-nose syndrome, WNS）的研究大多集中于单一高度易感物种——褐蝠（Myotis lucifugus）。另一易感物种三色蝠（Perimyotis subflavus）的种群下降程度与褐蝠相当或更严重，但研究不足，尤其是其针对WNS的免疫应答此前尚未得到评估。本研究开展了一项初步分析，将三色蝠对WNS的部分转录组（transcriptomic）应答与褐蝠应答进行比较。研究人员分析了2017年自美国肯塔基州Colossal Cave（该地WNS自2013年起存在）采集的14份三色蝠与13份褐蝠样本，并纳入1999年自附近冬眠点采集的26份WNS出现前的褐蝠样本。由于缺乏合适的三色蝠WNS前对照，研究人员在三组样本间开展两两差异表达（differential expression）分析，并通过评估结果间的重叠来推断三色蝠对WNS的部分应答。初步结果提示，三色蝠表现出易感物种特征的差异表达模式，包括在冬眠季末期仍明显可见的基因表达大幅变化。差异表达基因与免疫、代谢及昼夜节律功能相关，总体上与褐蝠中观察到的应答相似；但两物种所涉及的具体基因存在差异。总体而言，三色蝠似乎对WNS产生了显著的免疫应答，该应答与褐蝠相似但并不完全相同。
一、研究背景与问题提出
近几十年来，野生动物疾病不断涌现，对生物多样性构成重大威胁。壶菌病（chytridiomycosis）在两栖类中、传染性面部肿瘤病在袋獾（Sarcophilus harrisii）中均曾引发大规模死亡事件、种群急剧下降甚至灭绝。冬眠蝙蝠的白鼻综合征（WNS）是北美最严重的野生动物疾病之一，由入侵性真菌病原体假裸囊菌（Pseudogymnoascus destructans）引起，该病原体约于2006年自欧洲传入。冬眠期间，P. destructans定植于蝙蝠表皮组织，宿主对感染的应答触发频繁的蛰伏觉醒（torpor arousal）并消耗脂肪与水储备，部分蝙蝠物种种群下降已超过90%，持续威胁种群的长期存续。
尽管WNS具有重要保护意义，其病理生理学仅在少数物种中得到详细描述。在分子层面理解宿主应答有助于识别抗性（resistance）或耐受（tolerance）机制、改进种群轨迹预测并开发有效治疗策略。一项涵盖多种野生动物疾病系统的荟萃分析显示，73%的易感与非易感宿主物种比较中，易感类群表现出更大的转录组应答，可能反映病原控制无效或免疫系统失调（immune dysregulation）。然而，WNS研究中仅对褐蝠一种易感宿主的转录组应答进行了广泛考察，褐蝠在其感染范围内下降超过90%；除褐蝠外，仅大棕蝠（Eptesicus fuscus）的转录组谱得到评估，而后者被认为对WNS更具抗性。褐蝠表现出与其他易感野生动物类群一致的转录应答模式：基因表达大幅变化并持续整个冬眠期大部分时间；该应答类似哺乳动物典型的抗真菌防御，但适应性免疫（adaptive immunity）似乎受限，可能源于蛰伏的抑制状态。大部分免疫应答发生于周期性觉醒期间，而先天免疫（innate immunity）组分在蛰伏时仍保持活性。此类免疫活性看似有益，但维持高病原载量及整个冬眠期持续的免疫活动可能导致免疫病理（immunopathology），出眠时的全身性炎症及局部感染区之外的免疫活动即为证据。因此，褐蝠死亡主要被认为源于真菌生长与觉醒频率增加所致的生理紊乱。
三色蝠是另一种受WNS严重影响的物种，种群下降超过90%，在97%的调查冬眠点报告了疾病影响，与褐蝠相当。该物种历史上广泛分布于北美东部，如今日益稀少，已提议在美国列为联邦濒危物种。尽管疾病导致种群下降，其分子与生理应答仍大多未明确：已知三色蝠可产生针对P. destructans的抗体，细胞培养证据提示其对P. destructans感染存在免疫活性，但其他相关细节未知。重要的是，作为蝠属（Myotis）之外少数易感物种之一，三色蝠可能表现出对P. destructans感染的独特应答。为此，研究人员开展初步分析，以刻画三色蝠对P. destructans感染的转录组应答并与褐蝠比较，据其所知，这是三色蝠对WNS转录应答的首次描述，也是高度易感蝙蝠物种最早期的比较分析之一。
二、主要关键技术方法（不超过250字）
研究样本包括1999年3月采自肯塔基州Cave Hollow Cave的WNS前褐蝠翼膜活检样本（存于DMSO），以及2017年3月采自Colossal Cave的褐蝠与三色蝠翼膜活检样本（存于RNALater），后者为WNS暴露后样本。研究人员采用Quant-seq 3′ mRNA-seq建库，在Illumina NovaSeq平台单端测序；经去rRNA、质量修剪与污染序列过滤后，将读数比对至褐蝠参考基因组MyoLuc2.0，用HTSeq计数、DESeq2做差异表达分析与主成分回归（principal component regression），并以g:profiler进行基因本体（GO）富集分析；同时以比对至P. destructans基因组的读数比例比较物种间相对真菌载量。
三、研究结果
共采集55份样本，最终保留53份（WNS前褐蝠26份、WNS后褐蝠13份、WNS后三色蝠14份），平均保留253,675 ± 11,505条读数，共映射至5440个基因。质控分析提示各组样本可比，但三色蝠样本错配率更高、映射长度更短；参考偏倚与PCR重复分析未发现对结果的明显影响，尽管不能完全排除。
研究人员将WNS后三色蝠与WNS前褐蝠比较，鉴定出983个差异表达基因（上调636个、下调347个）；褐蝠应答鉴定出351个（上调203个、下调148个）；WNS后三色蝠与WNS后褐蝠比较鉴定出709个（上调441个、下调268个）。三色蝠与WNS前褐蝠比较的差异表达基因与褐蝠应答的Jaccard相似指数为0.11。通过比较三组差异表达结果，推测的共享应答包含122个基因（上调71个、下调51个），其中包括与免疫功能相关的C1R、CUEDC2、PGLYRP1与CSRP2，以及与代谢功能和昼夜节律相关的MIOS与NR1D1；上调基因中无过度代表的GO条目，下调基因中有乳酸酸中毒、酸中毒与pH稳态异常三个GO条目过度代表。尽管基因身份差异较大，两物种在同一功能类别中有许多基因差异表达，例如主要组织相容性复合体（MHC）I或II类在共享应答中仅与两个基因功能相关，而在仅见于三色蝠比较分析中的11个基因和仅见于褐蝠应答中的5个基因中亦有功能关联。一致的物种差异组包含397个基因（上调268个、下调129个），其中部分与免疫活性相关（如IRAK3、TNFSF10、CYLD、F3），部分与代谢功能相关（如CROT、ACSM3）；上调基因中22个、下调基因中8个GO条目过度代表，几乎均与一般细胞结构与过程相关。由此提示，两物种在免疫功能类别上存在广泛重叠但具体基因不同。
3.1 主成分回归
主成分分析（PCA）中PC1解释76.7%的方差，PC2解释7.4%。WNS后褐蝠的PC1变异大，远离其余两个更聚集的组；三组沿PC2分离。两主成分中样本组均为唯一有意义的解释协变量，性别与测序批次无显著效应。两两比较显示WNS后褐蝠PC1值显著高于WNS前褐蝠与WNS后三色蝠，而WNS前褐蝠与WNS后三色蝠间无显著差异；PC2值三组间均显著不同，WNS后三色蝠最高，其次为WNS后褐蝠。PC1与S100A12（r = 0.696）和S100A8（r = 0.657）表达强相关，PC2与S100A4（r = 0.541）高度相关。由此说明，褐蝠的WNS应答以S100A12/S100A8驱动的强表达变异为特征，而三色蝠在PC2轴上表现出独特的表达特征。
3.2 物种间相对P. destructans载量比较
过滤后，WNS后褐蝠与三色蝠样本平均含636 ± 175条比对至P. destructans基因组的读数，占总读数的1.88 × 10?4% ± 4.05 × 10?5%。三色蝠比对至P. destructans的读数比例显著低于褐蝠。这表明三色蝠的相对真菌载量较低，但其与种间免疫基因表达差异的关系无法据本研究数据确定。
四、讨论部分总结
讨论指出，WNS已导致多种北美蝙蝠严重种群下降，但物种特异性疾病应答的分子机制仍不完全清楚。研究结果提示三色蝠可能对P. destructans感染产生显著的转录组免疫应答，总体上类似褐蝠。由于缺乏WNS前三色蝠样本，难以区分观察到的差异表达中哪些与WNS应答相关、哪些为种间组成性差异；但推测共享应答与既往褐蝠研究的一致性支持三色蝠存在贯穿冬眠季的显著转录组应答这一假说。
推测共享应答涉及的免疫系统要素包括炎症、补体级联（complement cascade）、Toll样受体信号通路、NF-kb等免疫相关转录因子以及细胞因子信号与免疫细胞活化通路。例如观察到补体级联相关基因C1R上调，以及Toll样受体7/8信号通路相关基因MAPKAPK3、RPS6KA1与CUEDC2上调；这些通路的激活也见于既往褐蝠WNS转录组研究。既往研究多在觉醒间期采样，而本研究在蝙蝠自冬眠基质移出后不久采样，可能处于觉醒早期，其确切影响尚不清楚。部分转录活动可能与病理性免疫失调相关：共享应答中乳酸酸中毒、酸中毒与酸碱稳态异常GO条目过度代表，酸中毒可由CO2蓄积或电解质失衡引起，二者均曾在患WNS蝙蝠中描述；乳酸酸中毒常由脓毒性休克（septic shock）引起，PGLYRP1上调（该基因近期被纳入脓毒症诊断核心基因集）支持免疫失调的可能，类似系统性炎症与脓毒症指征也曾在患WNS褐蝠中观察到。但这些转录信号的解释仍不确定，例如冬眠哺乳动物因低血容量可出现生理性乳酸酸中毒。
除免疫通路外，三色蝠还表现代谢与昼夜节律变化：控制氨基酸饥饿下自噬调控的MIOS在两物种中均相对WNS前褐蝠下调，可能反映WNS相关的营养应激；四个与昼夜节律相关的基因（NR1D1、LDHB、NFIL3、DNM1L）在共享应答中差异表达，可能与患WNS蝙蝠蛰伏周期紊乱或种间蛰伏模式差异有关。总体而言，三色蝠的表观转录组应答与褐蝠相似，两物种均显示免疫通路激活、代谢改变及符合长期生理应激的转录信号；由于感染通常发生于冬眠季早期而样本采集于3月，持续的免疫激活提示该应答可能贯穿冬眠期大部分时间，此为易感宿主应答的特征，而抗性较强的大棕蝠与鼠耳蝠（Myotis myotis）则无此 prolonged 激活。
尽管功能上广泛相似，许多差异表达基因仍为物种特有，例如饥饿应答相关基因在三色蝠中为FOXK2与GPR155，在褐蝠中为SUPT20H与SNX7，仅MIOS见于共享应答。WNS后褐蝠S100A12与S100A8表达升高（驱动PCA最大变异轴，既往研究反复发现，与全身性炎症和脓毒症相关），而三色蝠相对WNS前及WNS后褐蝠均未升高这些基因，反而S100A4表达升高（同属S100家族，参与细胞因子信号与炎症调控，与慢性炎症及长期感染中的免疫改变相关）。这提示尽管整体免疫应答涉及相似通路并共享部分基因，驱动应答的具体基因在种间不同，类似野生鳉鱼种群对毒性的平行快速进化——选择作用于同一功能类别中的不同基因。这些差异对WNS病理生理学的意义仍不清楚，也可能反映有意义的疾病应答变异；比较WNS前后三色蝠的转录模式可直接考察其WNS应答。
样本采集时WNS已在北美存在约十年，有证据表明部分蝙蝠种群已开始快速进化应答，若干褐蝠种群在初期下降后出现恢复迹象，生理适应与选择基因组特征提示WNS驱动了基于既有遗传变异的进化；但并非所有物种都在适应，三色蝠是否发生类似进化应答仍不清楚，部分种群在初期下降后增长率上升，部分个体在反复年度感染下仍存活。因此，观察到的转录组应答是否会在初次暴露的未感染蝙蝠中出现、还是也反映适应或驯化，尚不明确；既往研究表明多代暴露的褐蝠维持被认为指示易感性的强烈免疫应答，但相关基因表达与初次暴露时不同。三色蝠的适应或驯化程度未知，同样可能影响转录模式。此外，褐蝠比对至P. destructans的读数比例显著高于三色蝠，可能与种间免疫基因表达差异有关，但本研究无法确定；本研究真菌RNA量较既往工作低，可能与随机采样而非针对病变采样有关，北美蝙蝠真菌载量荟萃分析也报告类似趋势。在三色蝠中相对褐蝠于WNS前后均差异表达的基因可能反映种间基线差异，其功能广泛涉及脂质代谢、皮肤完整性与细胞形态，GO分析提示结构分子活性、蛋白生物合成与细胞器等一般细胞功能过度代表，其生理后果仍不确定。
局限性部分指出：第一，三色蝠应答系通过与WNS前后褐蝠比较推断，表观差异可能反映与感染无关的种间差异；共享免疫通路同向调控支持至少部分转录应答与WNS病理相关，而与褐蝠应答不共享的差异表达可能主要为物种组成性差异，但即便为组成性差异也可能影响WNS病理，尤其是免疫基因。第二，三色蝠读数比对至褐蝠参考基因组可能引入参考偏倚，且WNS前样本采自约20年前的另一冬眠点、保存介质不同；但两物种比对质量指标大体可比，参考偏倚分析未显示明显影响，采样点地理相近且群体遗传学研究提示该尺度上两物种基因流高，种群差异不太可能解释观察到的表达模式。第三，数据集重复率高且建库未使用唯一分子标识符（UMI），结果可能受技术伪影影响；在缺乏UMI时通常建议不剔除重复，敏感性分析未提示明显问题。第四，采集翼活检未用紫外光引导靶向P. destructans损伤区域，故无法区分局部与全身应答，但该设计允许纳入既往采集样本并分析较多野生个体；所有WNS后样本均检出P. destructans RNA提示个体已感染，尽管读数比例很低提示未捕获大病变；鉴于病原存在多年后冬眠点几乎所有蝙蝠均被感染，观察到的转录信号很可能至少部分反映WNS感染。未来需纳入未感染三色蝠对照组、以紫外光引导采样区分全身与局部应答，并比对三色蝠参考基因组。
五、结论翻译
研究结果提示，三色蝠对P. destructans感染产生强烈的转录组应答，包括先天免疫通路激活、炎症信号以及伴随冬眠生理紊乱的代谢过程。这些应答总体上类似既往在褐蝠中描述者，提示两物种均表现出野生动物疾病系统中易感宿主的典型免疫激活模式。尽管存在机制上的相似性，驱动应答的基因集在两物种间并不完全相同，表明相似的功能结果可能通过不同的分子机制实现。理解这些差异如何影响WNS病理生理学与存活需进一步研究，尤其当蝙蝠种群持续承受疾病导致的生态与进化压力时。鉴于种间比较设计的局限，研究人员将这些结果作为初步结果报告；持续开展跨蝙蝠物种转录组与生理应答的比较研究有助于阐明受疾病威胁种群存活差异的驱动因素。
