《The FEBS Journal》：Breaking the ice: multiple origins of ice-binding/antifreeze proteins
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冰结合蛋白（ice-binding proteins, IBPs）使生物体能够通过与冰结合并抑制晶体生长而在冰冻环境中生存。它们显著的结构、分类和进化多样性使其成为研究蛋白质进化的一个卓越体系。本综述考察了鱼类、节肢动物、植物、微生物及其他类群中IBP的起源、
冰结合蛋白（ice-binding proteins, IBPs）使生物体能够通过与冰结合并抑制晶体生长而在冰冻环境中生存。它们显著的结构、分类和进化多样性使其成为研究蛋白质进化的一个卓越体系。本综述考察了鱼类、节肢动物、植物、微生物及其他类群中IBP的起源、结构和分布。比较基因组分析揭示了所有已知鱼类抗冻蛋白（antifreeze proteins, AFPs）的前体基因，其中富含丙氨酸的α-螺旋AFP显示出从不同前体反复趋同进化的特征。β-折叠螺线管（β-solenoid）型IBP在节肢动物、植物、真菌和微生物中多次独立出现。尽管这些蛋白质共享结合冰的能力，但它们的功能可能不同，其结构在折叠方式、架构和冰结合表面组成上存在显著差异。水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）在IBP进化中也发挥了重要作用，包括II型AFP基因在鱼类间的转移、DUF3494型IBP在细菌与众多真核生物间的转移，以及一种高活性β-折叠螺线管AFP在远缘甲虫谱系间可能的转移。IBP的鉴定面临显著的实验挑战，需要通过热滞（thermal hysteresis, TH）或冰重结晶抑制（ice recrystallization inhibition, IRI）测量结合重组表达进行严格验证。尽管如此，基因组测序、转录组学、蛋白质纯化和结构预测方面的进展正在迅速加速IBP的发现。总体而言，IBP展示了针对共同环境挑战的进化解决方案的非凡多样性，并为研究新型蛋白质功能产生的机制提供了一个强有力的模型。
鱼类AFP
据假设，早期脊椎动物在半咸水中进化，因为相对于海水它们是低渗的，其体液溶质浓度约为海水的三分之一。因此，鱼血的冰点约为-0.8°C，这在淡水中完全具有保护作用，而海水冰点约为-1.9°C。这促使Scholander等人质疑某些鱼类如何在过冷约1°C的情况下存活。他们确定，栖息于冰层覆盖浅水区的鱼类的血液在更低的温度下才结冰，但直到1969年，南极鱼类中才发现抗冻糖蛋白（antifreeze glycoproteins, AFGPs）。到1971年，有人提出非依数性热滞（thermal hysteresis, TH）活性源于AFGP吸附到冰晶上。随后，AFGP和AFP（统称为AF(G)P）在高纬度地区的多种鱼类中被鉴定出来。它们结合特定冰面的能力通过未标记AF(G)P产生的蚀刻图案、荧光标记AFP对单晶冰半球进行的荧光基冰面亲和力（fluorescence-based ice plane affinity, FIPA）分析，或微流控系统中对单个显微晶体的吸附观察得到证实。
鱼类通常不会暴露于低于海水冰点（-2°C）的温度，这比某些陆生生物所承受的极端温度温和得多。因此，其“中等活性”AFP的TH活性很少超过2°C，在同等浓度下比“超活性”节肢动物AFP低一到两个数量级。另外两个特征区分了这些AFP：首先，用较低浓度的鱼类AFP融化得到的单个冰晶类似于无AFP对照的冰晶；只有在TH间隙内过冷时，晶体才会沿c轴伸长形成六方双锥。相比之下，使用超活性AFP时，冰通常融化成具有六边形横截面的圆形晶体，并在整个TH间隙内保持此形状。其次，达到非平衡冰点时发生的冰爆发模式也不同：鱼类AFP的爆发沿c轴发生，而超活性AFP则沿a轴发生。
鱼类AF(G)P的结构多样性超过任何其他类群，涵盖球状蛋白、α-螺旋肽、螺旋束和简单的糖蛋白。这种多样性可能源于鱼类适度的TH需求，各种结构类型都能提供足够的保护。大多数鱼类依赖基因扩增以达到所需的蛋白质水平。例如，基因拷贝数从鲱鱼的8个，到星斑川鲽的33个，再到美洲大绵鳚的150个不等。在许多物种中，基因剂量与纬度相关，来自较冷区域的同种个体维持着更高的拷贝数。
III型AFP
III型AFP最早于1985年报道序列，其NMR和晶体结构分别在1993年和1996年获得。直到1999年，人们才注意到它与人类唾液酸合酶（sialic acid synthase, SAS）C端结构域具有36%的序列相似性。该基因很可能在2000万至3000万年前出现在北方绵鳚科鱼类中，一些物种仅在最近1000万年内才迁移到南极水域。III型AFP的冰结合表面（ice-binding surfaces, IBS）相对平坦且疏水，较大的表面结合冰的金字塔面，较小的表面结合棱柱面，但两种亚型均不保护基面，导致c轴向爆发。III型AFP起源于SAS基因的复制和随后的新功能化，这是一个逃避适应性冲突的例子。
II型AFPs
II型AFP存在于绒杜父鱼、胡瓜鱼和大西洋鲱等鱼类中，依赖二硫键维持活性结构，并且胡瓜鱼和鲱鱼的AFP是钙依赖性的。这些约17kDa的AFP与C型凝集素高度相似。最令人惊讶的是它们的分类分布：虽然绒杜父鱼和短吻八角鱼与胡瓜鱼亲缘关系更近，但它们的AFP与胡瓜鱼和鲱鱼的AFP之间序列一致性极低；相反，胡瓜鱼和鲱鱼的AFP编码区和内含子序列一致性高达85%-97%，考虑到这两个物种约2.5亿年的分离时间，这非同寻常，表明这些AFP基因是通过水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）在鱼类谱系间传递的。
AFGPs
AFGPs存在于南大洋的南极鱼亚目鱼类和北方的鳕科鱼类中。它们主要由Thr-Ala/Pro-Ala三肽重复单元组成，苏氨酸残基上连接有O-连接的二糖。南方鱼类的AFGP基因起源于一个复制的胰蛋白酶原基因，通过9核苷酸片段的重复扩增形成了构成AFGP主体的三氨基酸重复序列。北方鱼类的AFGP基因则独立地从非编码DNA中从头起源，两者是趋同进化的结果。
I型AFPs
富含丙氨酸的α-螺旋I型AFP存在于四个鱼类谱系中。它们通过不同的前体基因独立起源：鲽形目鱼类起源于抗病毒蛋白Gig2中一段短的α-螺旋片段；杜父鱼科鱼类起源于GIMAP（GTPase of immunity-associated proteins）蛋白C端的富丙氨酸区域；杜父鱼属鱼类通过lunapark基因座的收缩和移码突变产生；圆鳍鱼科鱼类则似乎源自转座子衍生序列。
IV型AFPs
LS-12蛋白从长角杜父鱼血液中分离，具有TH活性，被认为具有螺旋束折叠。然而，重组LS-12虽有TH活性，但在鱼血中含量不足以防止冻结，因此可被视为IBP而非AFP。
节肢动物AFPs
昆虫和其他陆生节肢动物会暴露于远低于鱼类的温度，因此采用多种策略越冬，包括过冷和耐冻。研究主要集中于展示高TH活性的昆虫，因为这些AFP被认为最具生物技术应用前景。
甲虫
第一个被纯化和克隆的昆虫AFP来自黄粉虫（TmAFP），是一种由二硫键加固的β-折叠螺线管，含有七个线圈，其IBS由两排苏氨酸残基形成TxT基序。另一种结构独特的β-折叠螺线管AFP来自长角天牛（RiAFP），每个链上有四个苏氨酸残基形成TxTxTxT基序。有趣的是，与TmAFP样AFP具有高达82%序列一致性的AFP也存在于锹形虫中，考虑到这两个甲虫谱系的古老分歧时间，这被认为是HGT的结果，可能由胞内共生菌沃尔巴克氏体介导。
蛾类
云杉卷叶蛾的AFP（CfAFP）与甲虫AFP共享许多特征：超活性、多亚型、结合冰的基面，并形成β-折叠螺线管结构。
