常规1型树突状细胞的生成与扩增策略：从细胞因子驱动培养到转录因子编程及内源性扩增

《European Journal of Immunology》：Generating and Expanding Conventional Type 1 Dendritic Cells

　　

摘要专业翻译 常规1型树突状细胞（conventional type 1 dendritic cells，cDC1s）是特化的抗原呈递细胞，在交叉呈递、针对胞内病原体的免疫以及抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。由于其在血液和多数组织中丰度低且可及性有限，研究者投入了大量工作以生成和扩增cDC1s，用于机制研究和转化研究。过去二十年间，cDC1生物学领域的进展使该领域从异质性的骨髓来源培养体系，逐步发展为能够生成、富集或扩增真正cDC1s（bona fide cDC1s）的日益精密的平台，同时也有部分方法的产品仍最宜归类为cDC1样细胞（cDC1-like cells）。本文综述了细胞因子驱动培养体系、Notch配体支持系统、人CD34+祖细胞及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源平台、基于转录因子的编程策略以及内源性cDC1扩增方法。研究人员根据谱系验证、富集程度、产量、培养时长、功能、可规模化性及转化成熟度等指标，区分了真正cDC1s、cDC1富集培养体系与cDC1样细胞，并对上述方法进行了系统比较。这些平台共同为cDC1研究及治疗开发提供了互补的工具。

论文主体内容专业总结

1 引言

常规1型树突状细胞（cDC1s）是特化的树突状细胞（dendritic cell，DC）亚群，在交叉呈递、针对胞内病原体的免疫及抗肿瘤免疫应答中发挥核心作用。cDC1s通过高效加工和呈递细胞相关抗原、协调适应性及固有免疫应答，在小鼠和人类中均是保护性免疫的关键调控者。过去十年间，cDC1的发育通路、转录网络和功能特化研究取得重大进展，但针对cDC1生成与扩增平台的系统比较相对不足。由于从血液和组织中获取足量cDC1s长期构成实验和转化研究的重大挑战，研究者开发了多种互补策略，包括扩增祖细胞群体、促进cDC1分化和维持、提供发育微环境信号、在其他细胞类型中诱导cDC1相关程序，或扩增内源性cDC1s。当前领域涵盖细胞因子驱动分化系统、Notch配体支持培养、人CD34⁺祖细胞平台、诱导多能干细胞（iPSC）来源方法、基于转录因子的编程策略以及体内内源性cDC1扩增方法。

2 生成cDC1的定义与基准验证

比较不同cDC1生成平台需明确区分细胞身份、培养组成与特定组织状态的对应关系。单一表面标志物或功能无法确立cDC1身份。在小鼠中，CD8α和CD103的表达随组织和分化状态而变化，CD11b可呈低表达或可变表达而非均匀缺失；在人类中，CD141同样支持但不能独立确立cDC1身份。交叉呈递和细胞因子产生亦非谱系特异性。当多种独立证据趋同一致时，cDC1归属的可信度最强，包括cDC1相关表型（如XCR1和CLEC9A表达）、缺乏优势cDC2、单核细胞或巨噬细胞程序、与cDC1发育回路（如IRF8–BATF轴）的一致性、与适当原代cDC1参考群体的转录组对齐，以及特征性功能特性。本文以"bona fide cDC1s"表示cDC1谱系归属而非与任何单一组织cDC1状态的等同；以"cDC1-like cells"表示具有部分cDC1相关特征但谱系身份或发育起源验证不完整的细胞；"cDC1-enriched culture"描述培养组成而非细胞身份。

3 细胞因子驱动的cDC1生成

最早广泛采用的体外DC生成方法依赖补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的骨髓培养体系，但这些培养体系异质性高且含大量巨噬细胞样细胞。Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）被确认为调控生理性DC发育的主要细胞因子后，Flt3L驱动的骨髓培养体系可生成浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）和常规树突状细胞（conventional dendritic cell，cDC），包括更接近体内对应物的cDC1和cDC2。CD103表达不应等同于cDC1谱系身份，因其为情境依赖性表型。补充干细胞因子（stem cell factor，SCF）可增加上游造血干/祖细胞的募集和扩增，从而提高cDC1产量。白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）可增加Flt3L骨髓培养中cDC1和cDC2的绝对产量并抑制pDC发育，其机制涉及早期IL-4Rα-STAT6依赖性效应和cDC1增殖促进。16天的诱导CD103⁺ DC（iCD103-DC）方案将低剂量GM-CSF与Flt3L结合，可富集功能性、Batf3依赖的CD103⁺ cDC1s。最新发展的诱导1型常规树突状细胞（induced type 1 conventional dendritic cell，iDC1）培养体系将Flt3L、SCF和低剂量GM-CSF与优化培养基及23天分化方案结合，可生成纯度超过95%的CD103⁺ cDC1s，产量显著高于早期细胞因子驱动体系。iDC1的身份由XCR1、CLEC9A和CD24表达、+32-kb Irf8增强子依赖性、与原代及培养来源cDC1的转录组对齐、固有免疫应答及细胞相关抗原交叉呈递等多重证据支持。

4 Notch配体支持的cDC1生成

Notch2在体内特定cDC亚群分化和稳态中的作用促使研究者将膜结合发育信号纳入体外cDC1生成体系，由此发展了使用表达Delta样1（Delta-like 1，DLL1）或Delta样4（Delta-like 4，DLL4）Notch配体的OP9基质细胞与Flt3L共培养的系统。这些体系生成包含cDC1和cDC2的混合cDC培养物。在小鼠培养中，Notch配体暴露促进CD8α、CD103和DEC205表达，使cDC1转录谱向原代脾脏cDC1偏移，并增强CCR7表达、向CCR7配体的迁移、CD8⁺ T细胞交叉致敏及抗肿瘤疫苗接种效果。人类祖细胞研究显示Notch配体暴露对cDC1产量的定量效应更为显著，DLL1支持培养可大幅增加IRF8依赖性CD141⁺ cDC1的生成。人胸腺中JAG1⁺髓质微环境支持GATA2依赖性祖细胞生成，DLL1在早期祖细胞阶段抑制髓系程序，而在共同树突状细胞祖细胞（common dendritic cell progenitor，CDP）形成后支持DC发育。Notch效应取决于配体和发育阶段。小鼠培养研究提示NOTCH2参与，而人类cDC1生成所涉及的受体或受体组合尚未被功能性确立。Notch支持体系存在饲养层依赖、多谱系输出、全培养组成报告不一致等局限。

5 人CD34⁺祖细胞生成cDC1

循环人cDC1的稀有性推动了从CD34⁺造血祖细胞体外生成这些细胞的大量研究。早期基于Flt3L的培养体系可生成多种人DC亚群，包括CD141⁺CLEC9A⁺ cDC1s、CD1c⁺ cDC2s和CD123⁺ pDCs，其中XCR1⁺CD141⁺CLEC9A⁺细胞在表型、转录组和功能上与血液cDC1相似，支持其cDC1谱系归属，但cDC1仅占总产量的少数。Notch配体表达饲养层体系可显著增加cDC1生成但仍为多谱系。在Flt3L培养中添加IL-4可大幅增加CLEC9A⁺CD141⁺ cDC1产量。无饲养层Flt3L/GM-CSF方案可生成大量CD141⁺CLEC9A⁺细胞，但因缺乏全面的发育和转录组基准验证，其产物最宜归类为cDC1样细胞。无血清DLL1支持体系可大规模生成cDC1，并通过表型、转录组学、交叉呈递和临床前疫苗接种对所得细胞进行了基准验证。近期预印本报告了一种符合药品生产质量管理规范（good manufacturing practice，GMP）的无饲养层工作流程，结合细胞因子优化与StemRegenin 1介导的祖细胞扩增，报告了高cDC1产量及与原代人cDC1的表型和单细胞转录组相似性。

6 iPSC来源的cDC1样细胞

诱导多能干细胞（iPSC）代表一种可再生的替代来源。早期研究证明iPSC可分化为含CD141⁺XCR1⁺ DC的异质性培养物，具有cDC1相关表型和功能特性包括交叉呈递，但未与原代cDC1进行全面发育和转录组基准比较。后续工作显示DLL1介导的Notch信号可促进iPSC来源CD34⁺祖细胞向cDC谱系分化，产生与血液cDC1具有单细胞转录组相似性的CD141⁺XCR1⁺CLEC9A⁺细胞，但培养物仍为异质性且含cDC2、DC3等群体。更近期的无饲养层扩增虽增加了DC产量，但所得表型定义的cDC1样、cDC2和DC3群体在转录组上最接近单核细胞来源DC而非原代cDC亚群。iPSC来源系统提供可再生和可工程化的cDC1样细胞来源，但谱系对应性呈方案依赖性，异质性输出、漫长的多步分化和与原代cDC1的不完全对应仍是重要局限。

7 基于转录因子的编程

直接谱系重编程通过强制表达谱系定义转录因子将体细胞直接转化为DC。PU.1、IRF8和BATF3的组合足以将小鼠和人类成纤维细胞重编程为具有cDC1样转录程序和抗原呈递功能的诱导DC，小鼠诱导DC还可向CD8⁺ T细胞交叉呈递抗原。单细胞转录组学研究定义了成功的重编程轨迹，添加干扰素γ、干扰素β和肿瘤坏死因子α可显著提高重编程效率，并支持从成人成纤维细胞和间充质基质细胞生成。机制上，PU.1早期结合染色质并招募IRF8和BATF3至共享调控位点，激活cDC1相关程序同时抑制成纤维细胞身份。在已建立的肿瘤内通过腺病毒递送PU.1、IRF8和BATF3可将肿瘤细胞重编程为cDC1样抗原呈递细胞，促进三级淋巴结构形成、多克隆T细胞应答扩增及多种黑色素瘤模型中的持久抗肿瘤免疫。这些细胞因绕过正常cDC1发育且与原代cDC1状态的等同性尚未完全确立，最宜归类为cDC1样细胞，相关方法仍处于临床前阶段。

8 内源性cDC1的扩增与动员

内源性cDC1体内扩增与动员是体外生成的替代策略。系统性Flt3L给药可显著扩增小鼠和人类的DC，但Flt3L扩增多种Flt3响应性DC群体而非选择性作用于cDC1。Flt3L介导的扩增单独可能不足以控制已建立的肿瘤，因此常与放疗或其他抗原释放来源、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂或CD40激动剂、免疫检查点阻断及抗原导向疫苗接种联合使用。在Oba等人发展的原位免疫调节方案中，Flt3L增加肿瘤驻留cDC1，但稳健的肿瘤消退需要放疗联合TLR3和CD40刺激；在Batf3缺陷骨髓重建的野生型宿主中治疗效果降至仅放疗水平，证明了对Batf3依赖性骨髓来源细胞的依赖。将Flt3L工程化为白蛋白融合蛋白可延长血清半衰期并增强肿瘤和引流淋巴结内的蓄积，实现比重组Flt3L更大的瘤内cDC1扩增。脂质纳米颗粒递送编码IRF8或NF-κB诱导激酶的mRNA可激活抗原呈递细胞，增加肿瘤和引流淋巴结中活化cDC1的数量，增强抗肿瘤CD8⁺ T细胞应答。

9 选择适当的cDC1策略

没有单一方法对所有应用均最优，cDC1策略的选择应由生物学问题和预期应用指导。相关标准包括物种和起始材料、谱系验证强度、全培养组成、cDC1纯度和绝对产量、培养时长、遗传可操作性及转化成熟度。常规Flt3L和Flt3L+SCF骨髓培养适合DC发育和祖细胞生物学的机制研究；iCD103和iDC1在需要富集或高纯度小鼠cDC1时更为优选，代价是培养时间更长。Notch支持体系可分析膜结合微环境信号但仍依赖饲养层且多谱系。人CD34⁺祖细胞平台涵盖从异质性发育模型到可规模化cDC1生产系统，应根据谱系基准、饲养层依赖性和生产要求选择。iPSC来源方法提供可再生和可工程化的cDC1样细胞来源但需漫长多步分化。直接转录因子编程可绕过祖细胞阶段快速诱导cDC1样状态但仍处于临床前阶段。

10 结论与未来展望

过去二十年间，cDC1生成与扩增策略已从异质性细胞因子培养发展为涵盖优化细胞因子驱动分化、基质支持系统、人CD34⁺祖细胞培养、iPSC来源cDC1样细胞、转录因子介导编程及内源性cDC1扩增的多样化工具集。这些方法生成的产品从异质性或cDC1富集培养到高纯度bona fide cDC1s和cDC1样细胞不等，应视为互补而非可互换。重要挑战仍然存在：单一标志物或功能不足以确立cDC1身份，平台间比较需要汇聚发育、表型、转录组和功能证据。研究应报告起始材料、培养时长、细胞密度、培养基和细胞因子条件、以共同分母表示的完整细胞组成、绝对cDC1产量及用于基准验证的原代cDC1参考群体。未来工作应定义Notch调控小鼠和人类cDC1分化的受体使用、发育窗口、细胞因子协同及下游转录和染色质程序，优先发展无饲养层和组成明确的人源系统，并建立身份、效力、生产一致性和临床就绪性的可重复标准。体外生成和内源性扩增仍为互补策略，将各自独特能力匹配至特定机制和转化应用，同时严格验证谱系身份和功能，将决定各平台的效用。