肌动蛋白丝成束蛋白Fimbrin Sac6与V型肌球蛋白Myo2在酵母减数分裂期SUN结构域蛋白Mps3运动中的作用

《Genes to Cells》：The Role of Actin-Filament Bundling Protein, Fimbrin Sac6, and Type-V Myosin Myo2, in the Motion of the SUN-Domain Protein, Mps3, During Yeast Meiosis

　　

在减数分裂过程中，端粒的簇集与运动促进同源染色体之间的配对。在芽殖酵母（budding yeast）中，细胞质内的肌动蛋白丝（actin filaments）驱动由SUN结构域蛋白Mps3构成的连接核骨架与细胞骨架的复合物（Linker Nucleoskeleton and Cytoskeleton, LINC）在核膜（nuclear envelope, NE）上的运动，该复合物负责将端粒锚定并以运动方式牵拉至核膜。本研究中，研究人员分析了两种肌动蛋白结合蛋白——必需的V型肌球蛋白（Type-V myosin, Myo2）与Sac6 fimbrin（其功能为将肌动蛋白丝成束为肌动蛋白束）——在减数分裂期Mps3于核膜上运动中的作用。减数分裂特异性缺失MYO2可降低Mps3斑块（patches）的运动，而在减数分裂前期I（meiotic prophase I）并未影响细胞质肌动蛋白束，证实了Mps3运动依赖于肌动蛋白/肌球蛋白。此外，在缺乏减数分裂黏连蛋白（cohesin）组分Rec8的情况下，Myo2对维持Mps3簇集、并很可能维持端粒簇集起关键作用。在减数分裂期敲除SAC6（该基因对细胞质中的力产生至关重要）会显著减少细胞质肌动蛋白束，但未影响Mps3的定位与运动。因此，Sac6介导的肌动蛋白丝成束很可能并非Mps3斑块减数分裂期运动的关键因素。本研究提示，肌动蛋白聚合与Myo2介导的力共同参与酵母LINC复合物的减数分裂期运动。

在减数分裂过程中，端粒通过LINC复合物锚定于核膜并借助细胞骨架驱动力完成运动与簇集，这一过程在多种模式生物中高度保守。多数生物（如裂殖酵母、秀丽隐杆线虫、拟南芥和小鼠）利用微管（microtubule, MT）及其上的动力蛋白（dynein）或驱动蛋白（kinesin）驱动LINC复合物运动，进而带动端粒乃至整个染色体运动以促进同源染色体配对。芽殖酵母则不同，其端粒簇集较为松散（"loose" bouquet），并依赖细胞质中的肌动蛋白丝而非微管驱动端粒运动。酵母中肌动蛋白丝通过成束蛋白形成肌动蛋白束，与KASH结构域蛋白Mps2结合，后者经与V型肌球蛋白Myo2的相互作用招募Csm4，并与SUN结构域蛋白Mps3及减数分裂特异性端粒结合蛋白Ndj1共同将端粒锚定到内核膜。Mps3在减数分裂前期I于核膜上形成多个动态运动的斑块，其运动被认为是肌动蛋白驱动力的结果；用LatB抑制肌动蛋白聚合可降低Mps3运动而不影响斑块形成，且细胞质肌动蛋白束在减数分裂前期I被诱导形成。然而，肌动蛋白束/丝如何在减数分裂细胞中形成并调控核膜上的Mps3-Mps2-Csm4复合物尚不清楚；除Myo2外，多数肌动蛋白结合蛋白在减数分裂染色体/端粒运动（包括Mps3动态）中的作用基本未知；此外，控制Mps3斑块解簇集（即松散端粒簇集的基础）的力类型亦不明确。为此，研究人员利用减数分裂特异性缺失突变体重新评估并确认了Myo2在核膜Mps3斑块运动中的作用，发现Myo2对缺乏Rec8（减数分裂特异性黏连蛋白组分）时的端粒簇集维持是重要的，并揭示了Sac6 fimbrin（在肌动蛋白束中交联肌动蛋白丝）在减数分裂期肌动蛋白束形成中的新作用；研究最终表明，Sac6介导的肌动蛋白丝成束/交联对核膜上Mps3运动并不重要，而肌动蛋白聚合则是必需的。

在技术方法方面，研究以SK1双倍体酵母菌株（衍生自MSY832/833）为材料，构建了CLB2启动子驱动的减数分裂特异性缺失突变体（MYO2mn、SAC6mn）及生长素诱导降解子（auxin-inducible degron, AID）标记的MYO2-AID菌株（源于M. Knopp赠送的ABP140-4xGFP等株系），通过减数分裂时间进程培养（SPS/SPM培养基转换）、活细胞延时荧光显微成像与Mps3-GFP/Abp140-GFP单斑块追踪（ImageJ/MTrack2与Imaris软件）、高斯混合模型（mixtools R包）分析速度组分、Phalloidin染色观察肌动蛋白聚合物、DAPI染色计数减数分裂I进程及免疫印迹（Western blotting）检测Rec8、Dmc1、Ndt80、Cdc5、Myo2、Sac6等蛋白表达来开展研究。

研究结果方面：其一，"V型肌球蛋白Myo2对Mps3运动至关重要"。研究人员确认野生型减数分裂中Mps3-GFP由孢子极体（SPB）单一点状逐步形成3–5个乃至覆盖核膜的多个斑块，LatB处理不改变斑块定位但使平均速度由0.09 μm/s降至0.052 μm/s；高斯混合模型显示Mps3运动含快速与慢速两种组分，前者对LatB敏感，提示运动由肌动蛋白依赖性与非依赖性力共同驱动。MYO2mn细胞减数分裂I起始与孢子存活率正常，前期I进程正常，Mps3斑块形成动力学与野生型相似，但5 h时斑块平均速度降至0.076 μm/s，且LatB可进一步降低速度；为进一步耗竭Myo2而构建的MYO2-AID在生长素处理下于迟前期I阻滞，Mps3斑块定位不受影响，但速度由0.086降至0.052 μm/s，与LatB处理相似，且快速组分对Myo2耗竭敏感；在斑块形成前（2 h）耗竭Myo2不影响斑块出现；同时Phalloidin染色显示MYO2mn与MYO2-AID细胞的细胞质肌动蛋白束形成正常且对LatB敏感，表明肌动蛋白束形成不依赖Myo2。其二，"Sac6 fimbrin对肌动蛋白束形成至关重要，但对Mps3运动不重要"。SAC6mn突变体中HA-Sac6蛋白水平在5 h降至0 h的约1/3，减数分裂I起始延迟约2 h，孢子存活率降至85.0%；Phalloidin染色显示SAC6mn细胞肌动蛋白束形成大幅减少（5 h仅约10%细胞含肌动蛋白束），Abp140-4xGFP束标记亦大幅减少而皮质斑块占主导，残余束信号可被LatB消除；SAC6mn中Mps3斑块形成正常，5 h时斑块平均速度为0.096 μm/s，与野生型无显著差异，8 h为0.075 μm/s，且LatB处理仍可降低其速度，提示Sac6介导的成束并非Mps3运动的关键。其三，"Myo2对rec8突变体中Mps3簇集的维持是必需的"。rec8突变体于3 h起始Mps3簇集并持续存在，LatB可迅速解除簇集，提示簇集是肌动蛋白聚合介导力的敏感读出；rec8 MYO2mn在3、5 h仍见簇集，但8 h后簇集解除、核膜布满Mps3斑块，而LatB可迅速解簇，提示Myo2在缺乏Rec8时维持Mps3簇集；rec8 SAC6mn细胞在前期I持续累积Mps3簇集，LatB同样可解簇，支持Sac6（很可能是肌动蛋白束）对Mps3斑块运动与簇集维持不重要。此外，研究人员意外发现rec8突变体除内部肌动蛋白束外还形成靠近质膜和/或细胞壁的皮质肌动蛋白束，其在晚期细胞中占多数、对LatB敏感，但其形成不依赖Myo2与Sac6，与依赖Sac6的内部肌动蛋白束不同。

讨论部分指出，多数生物利用微管及动力蛋白/驱动蛋白驱动LINC复合物运动，而芽殖酵母利用肌动蛋白聚合（很可能是肌动蛋白丝或束）；既往研究提示Myo2参与Mps3-Mps2-Csm4复合物运动，但其他肌动蛋白结合蛋白的作用尚不明确。本研究通过减数分裂特异性MYO2缺失突变体确认了Myo2在Mps3运动中的作用，并发现Myo2耗竭可在rec8突变体中解除Mps3簇集，提示Myo2很可能在端粒簇集维持中起关键作用；鉴于野生型细胞仅瞬时形成簇集，Myo2介导的力是否在野生型中解除Mps3或端粒的松散簇集尚不明确。关于Sac6，其耗竭大幅减少细胞质肌动蛋白束却不影响Mps3运动，提示Mps3运动可能不依赖肌动蛋白丝成束/交联或肌动蛋白束，而依赖肌动蛋白聚合，一种简单解释是Phalloidin与Abp140-GFP无法可视化的单根或少数肌动蛋白丝可能参与运动，但不能排除对检测方法不敏感的"不可见"肌动蛋白束的作用；鉴于另一交联蛋白Scp1与Sac6在内吞中功能冗余，需进一步研究其他肌动蛋白结合蛋白以确定肌动蛋白束/丝与减数分裂期LINC复合物运动的关系。此外，肌动蛋白束如何在前期I被特异性诱导、减数分裂细胞中肌动蛋白丝的成核部位以及肌动蛋白丝如何在缺乏组织中心的情况下介导端粒簇集等问题仍有待未来研究。研究结论可译为：本研究提示，肌动蛋白聚合与Myo2介导的力共同参与酵母LINC复合物的减数分裂期运动；Myo2对Mps3运动及缺乏Rec8时Mps3簇集的维持是重要的，而Sac6介导的肌动蛋白丝成束对Mps3运动并非关键，尽管肌动蛋白聚合本身是必需的。