人参皂苷Rg1通过调控ABCB1介导的线粒体功能障碍缓解慢性阻塞性肺疾病

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Ginsenoside Rg1 Alleviates Chronic Obstructive Pulmonary Disease Partially Through Regulating ABCB1-Mediated Mitochondrial Dysfunction

　　

为探究人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1）对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）肺损伤的保护作用，并阐明其涉及ATP结合盒B亚家族成员1（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）介导的线粒体功能调控的潜在机制。通过香烟烟雾暴露建立COPD大鼠模型，随后体内给予不同剂量的人参皂苷Rg1。通过尾静脉注射短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）实现ABCB1敲低。采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色和Masson染色评估肺组织病理学及胶原沉积。通过测定吸气阻力（inspiratory resistance，Ri）、动态肺顺应性（dynamic lung compliance，Cdyn）以及0.3 s用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV_0.3/FVC）评估肺功能。体外采用香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）诱导人支气管上皮（human bronchial epithelial，HBE）细胞损伤，随后给予Rg1处理并进行ABCB1过表达或敲低。检测晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end products–receptor for advanced glycation end products，AGEs–RAGE）及早期生长反应蛋白1-c-Jun氨基末端激酶（early growth response protein 1–c-Jun N-terminal kinase，EGR1–JNK）信号通路。在COPD大鼠中，Rg1显著减轻肺泡结构破坏与胶原沉积，降低Ri，升高Cdyn及FEV_0.3/FVC。ABCB1敲低可部分逆转上述保护作用。在HBE细胞中，Rg1增强细胞活力，恢复线粒体膜电位，减少细胞凋亡，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄积，并挽救细胞内ATP耗竭。Rg1以与ABCB1表达上调相关的方式抑制AGEs–RAGE及EGR1–JNK通路的激活。人参皂苷Rg1部分通过上调ABCB1表达增强线粒体功能，从而缓解COPD大鼠及CSE处理HBE细胞的线粒体功能障碍。

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以肺实质慢性炎症反应为特征的呼吸系统疾病，是主要致死病因之一，带来沉重的社会经济负担。香烟烟雾（cigarette smoke，CS）暴露仍是其首要病因学因素，可引发持续的上皮损伤、炎症细胞浸润、气道重塑及肺气肿性破坏。尽管对症治疗已有进展，但仍缺乏能够阻止或逆转结构损伤的有效疾病修饰疗法。越来越多证据表明线粒体功能障碍是COPD发病的核心事件，在COPD患者气道上皮细胞和肺组织中可广泛观察到线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）受损、活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度产生、线粒体动力学紊乱及生物能量学衰竭；线粒体功能障碍不仅放大氧化应激，还促进炎症信号和细胞凋亡，加剧肺损伤并加速疾病进展。然而，将线粒体功能障碍与COPD慢性炎症联系起来的分子机制尚未完全阐明，确定上游调控靶点具有重要治疗意义。人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，Rg1）是三七/人参的主要生物活性成分，在多种疾病模型中表现出抗炎、抗氧化和细胞保护特性，可改善急性肺损伤等条件下的肺损伤、减轻炎症反应并维持线粒体完整性，还可稳定MMP、减少线粒体ROS蓄积并调控线粒体相关信号通路。但Rg1是否通过调节线粒体功能在COPD中发挥保护作用及其确切分子靶点尚待阐明。此外，ATP结合盒B亚家族成员1（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）作为一种传统上被认为参与药物外排的跨膜转运蛋白，近来被发现与细胞应激反应和线粒体稳态相关，其表达失调可能影响氧化应激、凋亡和炎症信号，但ABCB1在COPD中的表达模式及功能意义，尤其是与线粒体功能障碍的关系，尚未完全阐明。基于此，研究人员提出假说：Rg1部分通过上调ABCB1表达，从而恢复线粒体功能并抑制炎症反应，缓解COPD相关肺损伤；并设计在动物和细胞模型中评估Rg1对COPD的保护作用，阐明这些效应是否通过ABCB1依赖的线粒体功能调控介导。

在技术方法上，研究人员采用香烟烟雾暴露12周建立COPD大鼠模型并以不同剂量Rg1灌胃干预，通过尾静脉注射慢病毒载体实现ABCB1敲低（sh-ABCB1）及阴性对照（sh-NC）；体外以10%香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）诱导人支气管上皮（human bronchial epithelial，HBE）细胞损伤模型并给予不同浓度Rg1及ABCB1过表达或敲低。主要关键技术包括：HE与Masson染色评估肺组织病理与胶原沉积、小动物肺功能检测系统测定Ri、Cdyn及FEV_0.3/FVC、ELISA检测IL-6与TNF-α、CCK-8与TUNEL分别检测细胞活力与凋亡、JC-1与MitoSOX分别检测MMP与线粒体ROS、免疫组化与Western blot及RT-qPCR检测ABCB1及通路蛋白表达、透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察线粒体形态、ATP检测试剂盒测定细胞内ATP，并结合GSE94916数据集差异基因分析与分子对接。样本队列来源为公共基因表达数据集GSE94916及购自SJA公司（长沙）的Sprague–Dawley大鼠、购自Procell（武汉）的HBE细胞。

研究结果方面：3.1 Rg1减轻COPD大鼠模型肺损伤与炎症——通过HE与Masson染色、肺功能检测及ELISA发现，模型组肺泡结构破坏、炎症细胞浸润及胶原沉积明显，Ri升高而Cdyn与FEV_0.3/FVC降低，IL-6与TNF-α升高，Rg1呈剂量依赖性改善上述指标，表明Rg1可减轻肺损伤与气道重塑、抑制炎症并恢复肺功能。3.2 Rg1缓解HBE细胞CSE诱导的炎症损伤与线粒体功能障碍——通过CCK-8、TUNEL、JC-1、MitoSOX、ATP检测及ELISA发现，Rg1剂量依赖性提高细胞活力、减少凋亡、恢复MMP、降低ROS、挽救ATP耗竭并抑制IL-6与TNF-α，表明Rg1可有效缓解CSE诱导的炎症损伤和线粒体功能障碍。3.3 ABCB1在COPD中下调并可能为关键靶点——通过GSE94916数据集分析获得421个差异表达基因，与100个预测Rg1靶点取交集得到4个关键基因（ABCB1、NR3C2、PDE4D、TNF），其中ABCB1显著下调且与疾病进展密切相关，并经免疫组化与Western blot在体内外验证其表达降低，提示ABCB1可能是参与疾病进展的核心靶点。3.4 ABCB1过表达抑制线粒体功能障碍并减轻HBE细胞损伤——通过RT-qPCR、Western blot及功能检测发现，ABCB1过表达可抑制AGEs–RAGE与EGR1–JNK通路激活，增强细胞活力、减少凋亡、恢复MMP、降低线粒体ROS、挽救ATP耗竭并减少IL-6与TNF-α，表明ABCB1过表达在COPD细胞中发挥保护作用。3.5 Rg1通过上调ABCB1增强线粒体功能并抑制HBE细胞损伤——分子对接显示Rg1与ABCB1结合亲和力为–7.9 kcal/mol，并与LYS-826（2.0 ?）和SER-813（2.2 ?）形成氢键；挽救实验显示Rg1抑制AGEs–RAGE与EGR1–JNK通路激活及改善细胞活力、凋亡、MMP、ROS、ATP和炎症因子的效应在ABCB1敲低后被显著削弱，表明Rg1的保护作用与ABCB1表达上调相关。3.6 Rg1以与调控ABCB1相关的方式改善COPD大鼠线粒体功能障碍与肺损伤——通过HE、Masson、肺功能、TEM及ELISA发现，Rg1改善肺结构损伤、减少肺泡破坏与胶原沉积、降低Ri并升高Cdyn与FEV_0.3/FVC、减轻线粒体肿胀与空泡化、降低血清IL-6与TNF-α，而ABCB1沉默可部分削弱这些改善，表明Rg1对COPD大鼠的保護作用与ABCB1调控相关。

讨论部分总结：研究人员指出线粒体功能障碍不仅是烟雾暴露的继发后果，更是上皮易损性和疾病进展的主动驱动因素；本研究显示Rg1改善COPD肺损伤和线粒体功能障碍与上调ABCB1及抑制AGEs–RAGE和EGR1–JNK信号相关。Rg1不仅抑制炎症，还改善Ri、Cdyn和FEV_0.3/FVC等功能指标，但停药后疗效的持续性仍需证实以确认真实的疾病修饰作用；Rg1稳定线粒体功能可能源于维持生物能量完整性并阻止ROS介导的促炎级联激活。安全性方面，Rg1在常用实验剂量范围内毒性较低，本研究中未见明显不良反应。研究首次将ABCB1与气道上皮细胞线粒体稳态相联系，ABCB1过表达可抑制AGEs–RAGE和EGR1–JNK激活，提示ABCB1可能作用于应激反应信号的上游。作者也指出局限：未采用药理抑制剂或基因敲除实现ABCB1完全功能缺失，故Rg1是否严格依赖ABCB1尚待验证，目前数据仅支持部分依赖；CS大鼠模型与CSE-HBE细胞无法完全再现人类COPD的复杂性与异质性；COPD发病涉及NF-κB、Nrf2及线粒体自噬等多网络，Rg1可能存在ABCB1非依赖的额外效应。研究结论译为：总之，研究结果表明Rg1缓解COPD相关肺损伤的作用与ABCB1上调、线粒体功能恢复以及AGEs–RAGE和EGR1–JNK信号抑制相关；尽管这些发现凸显ABCB1介导的线粒体调控是Rg1治疗COPD的有前景的治疗轴，但仍需更多机制性、转化性及长期研究来证实其临床潜力并完善线粒体靶向治疗策略，尤其是纳入ABCB1完全功能缺失方法和停药后疗效评估的研究，对于确定Rg1是否发挥真正的疾病修饰作用及确立ABCB1介导这些获益的因果作用至关重要。