《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Ursodeoxycholic Acid Confers Neuroprotection in Rats With Acute Cervical SCI and Attenuates NLRP3/Caspase-1/GSDMD Pyroptotic Signaling
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脊髓损伤（SCI）给患者带来显著且持久的功能障碍。继发性损伤是SCI后功能恢复的关键决定因素，其中由NLRP3炎症小体及其下游炎症级联反应驱动的焦亡是这一过程的重要促成因素。熊去氧胆酸（UDCA）作为一种内源性次级胆汁酸，通过抗氧化和抗炎作用展现出神经保护活性
脊髓损伤（SCI）给患者带来显著且持久的功能障碍。继发性损伤是SCI后功能恢复的关键决定因素，其中由NLRP3炎症小体及其下游炎症级联反应驱动的焦亡是这一过程的重要促成因素。熊去氧胆酸（UDCA）作为一种内源性次级胆汁酸，通过抗氧化和抗炎作用展现出神经保护活性，并可能抑制焦亡。本研究旨在探讨UDCA对SCI的神经保护作用及其潜在机制。研究人员分别或同时使用脂多糖（LPS）和UDCA处理BV2小胶质细胞，并通过CCK-8法和免疫荧光分别评估细胞活力和NLRP3炎症小体蛋白表达。此外，在建立大鼠C5颈髓SCI模型后，研究人员通过口服灌胃给予UDCA治疗7天。采用行为学评估（圆筒爬壁试验）、苏木精-伊红（HE）染色、蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光和酶联免疫吸附测定（ELISA）等多种技术，分析功能恢复、组织病理学损伤、NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路关键蛋白表达及下游炎症反应。结果显示，适当浓度的UDCA可提高BV2细胞活力并抑制LPS刺激引起的NLRP3上调。口服灌胃UDCA与急性C5颈髓SCI大鼠前肢运动功能改善及脊髓组织病理损伤减轻相关。此外，该治疗与SCI激活的NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路关键组分丰度改变、离子化钙结合适配分子1（Iba-1）表达降低以及血清白细胞介素-18（IL-18）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度下降相关，提示神经焦亡受到抑制，损伤后过度炎症反应得到缓解。综上所述，UDCA在急性C5颈髓SCI模型中减轻继发性损伤并改善前肢功能，同时减弱NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的焦亡及后续炎症反应。以焦亡为靶点，UDCA有望成为SCI的新型治疗候选药物。
论文解读
一、研究背景与目的
脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的中枢神经系统创伤性疾病，常导致严重且持久的神经功能缺损，严重者可危及生命。颈髓损伤约占所有SCI病例的60%，其中以第五颈髓节段（C5）受累最为常见，常导致损伤平面以下感觉和/或运动功能的部分或完全丧失。SCI的病理进展通常分为两个阶段：原发性损伤（即刻机械性损伤）和继发性损伤（后续病理级联反应）。继发性损伤在原发性损伤基础上进一步加剧组织破坏并扩大损伤范围，涉及免疫激活和炎症等多种复杂病理生理机制，是SCI后功能恢复的关键决定因素，也是极具前景的治疗靶点。
NLRP3炎症小体是先天免疫系统的胞质多蛋白复合物，主要表达于小胶质细胞——中枢神经系统的常驻巨噬细胞。在稳态条件下，NLRP3处于静息自抑制状态；当受到病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）等应激刺激时，NLRP3发生构象改变并被激活，招募ASC适配蛋白和前体Caspase-1，促进Caspase-1活化。活化的Caspase-1催化前体IL-1β和前体IL-18成熟为具有生物活性的IL-1β和IL-18，同时介导消皮素D（GSDMD）的蛋白水解加工，释放的N端结构域在质膜上形成孔道，最终引发焦亡。NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴已被确定为SCI后继发性损伤进展的关键介质。一方面，SCI后局部和全身释放大量PAMPs和DAMPs，刺激NLRP3炎症小体活化，诱导焦亡，导致过度细胞死亡和显著炎症；另一方面，焦亡导致神经元丧失和功能障碍，加剧SCI相关的继发性损伤。因此，以安全有效的干预措施靶向NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的焦亡，有望预防和控制SCI后的继发性损伤，具有重要治疗意义。
熊去氧胆酸（UDCA）是一种内源性次级胆汁酸，是熊胆相关药物（在传统中医中应用数千年）的核心生物活性成分。现代纯化或合成的UDCA制剂已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于特定胆汁淤积性疾病的管理。除经典的肝脏保护作用外，UDCA还具有抗氧化、抗炎、细胞保护和免疫调节等多种药理活性。已有实验研究证实UDCA可改善胸段SCI大鼠的后肢运动功能，但在颈髓SCI模型中的神经保护作用及其对前肢运动功能的改善作用研究仍十分有限。此外，既往研究表明UDCA在动脉粥样硬化和大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中可有效抑制NLRP3炎症小体，减轻炎症并延缓病变进展。这些发现提示UDCA可能具有调节SCI中NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡信号通路的潜力，但当前该领域研究仍较为匮乏。
基于上述背景，本研究首先通过体外实验评估UDCA对脂多糖（LPS）诱导的BV2小胶质细胞NLRP3蛋白表达的影响，为UDCA减弱焦亡通路激活的潜力提供机制基础；随后建立大鼠急性C5颈髓SCI模型，系统评估运动功能障碍和脊髓组织病理学变化，阐明UDCA对功能恢复和组织修复的调节作用；同时分析NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴关键组分及下游炎症介质的表达变化，为UDCA在SCI治疗中抑制炎症小体激活和抗焦亡活性提供分子水平证据。
二、主要技术方法
研究人员采用体外与体内相结合的研究策略。体外实验中，使用小鼠BV2小胶质细胞系（购自武汉普诺赛生命科技有限公司，2024年10月），分为空白对照组、LPS刺激组（100 ng/mL LPS处理24小时）和UDCA干预组（50 μmol/L UDCA预孵育12小时后加入100 ng/mL LPS继续培养24小时）。采用CCK-8法检测细胞活力，免疫荧光法评估NLRP3蛋白表达。体内实验中，使用SPF级成年雄性Sprague-Dawley大鼠（购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（北京）2019-0010），体重240–290 g，随机分为假手术组（Sham）、SCI组和SCI+UDCA组，每组12只。采用医疗动脉瘤夹（夹持力70 g）建立C5右侧半侧钳夹SCI模型，SCI+UDCA组术后立即通过口服灌胃给予UDCA（25 mg/kg/天，溶于含1% DMSO的生理盐水），连续7天。主要检测手段包括：圆筒爬壁试验评估前肢运动功能；HE染色评估脊髓组织病理损伤和空洞面积；Western blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD及N-GSDMD蛋白表达；免疫荧光检测脊髓组织Iba-1表达；ELISA检测血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平。
三、研究结果
3.1 适当浓度的UDCA可增强BV2细胞活力
CCK-8检测结果显示，在UDCA单独处理及UDCA与LPS联合处理条件下，BV2细胞活力均呈现先升高后降低的趋势。在UDCA单独处理实验中，当UDCA浓度达到100 μmol/L时，细胞活力被显著抑制（p<0.01）。在UDCA与LPS联合处理实验中，各浓度间细胞活力无统计学显著差异，但在100 μmol/L时达到最低水平。据此确定50 μmol/L为后续实验的工作浓度。
3.2 UDCA抑制LPS诱导的BV2细胞NLRP3表达
免疫荧光定量分析显示，LPS刺激后BV2细胞NLRP3荧光信号强度较对照组显著上调（p<0.0001）；而UDCA联合处理可显著降低NLRP3荧光强度（p<0.05）。结果表明UDCA有效抑制LPS诱导的BV2细胞NLRP3表达上调。
3.3 UDCA促进急性颈髓SCI大鼠病理损伤恢复并改善前肢运动功能
HE染色显示，Sham组脊髓结构完整，灰白质界限清晰；SCI组脊髓结构严重破坏，出现广泛囊腔形成，神经元密度显著降低；UDCA治疗组组织损伤减轻，囊腔面积缩小，结构完整性部分恢复。ImageJ定量分析证实UDCA治疗显著降低空洞面积百分比（p<0.01）。圆筒爬壁试验结果显示，术前各组患肢使用率无显著差异；术后第1天SCI组和SCI+UDCA组均出现明显的运动代偿行为，患肢使用率急剧下降（p<0.0001）；SCI+UDCA组在第5天即出现显著改善（p<0.0001），而SCI组直至第7天才观察到显著改善（p<0.01）；术后第5天起，SCI+UDCA组圆筒爬壁试验评分显著高于SCI组（p<0.001）。结果表明UDCA治疗加速了急性颈髓SCI大鼠的运动恢复。
3.4 UDCA抑制急性颈髓SCI大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡信号级联关键组分表达
Western blot结果显示，SCI组脊髓组织中NLRP3、GSDMD和N-GSDMD蛋白水平较Sham组显著升高（p<0.05），Caspase-1表达呈上升趋势。UDCA干预显著抑制NLRP3炎症小体活化（p<0.05），显著下调GSDMD表达（p<0.001），并控制Caspase-1蛋白活化及N-GSDMD形成。结果表明UDCA治疗可部分抵消SCI诱导的焦亡通路激活并抑制其关键蛋白的过度表达。
3.5 UDCA减轻SCI诱导的局部组织和全身炎症
免疫荧光染色显示，SCI组脊髓损伤灶周围Iba-1免疫反应性较Sham组显著上调（p<0.001），UDCA治疗可降低Iba-1信号（p<0.05），提示小胶质细胞活化减少。ELISA结果显示，SCI组血清IL-18（p<0.0001）、IL-1β和TNF-α（p<0.05）水平较Sham组显著升高；UDCA干预显著降低血清IL-18（p<0.0001）以及IL-1β和TNF-α水平（p<0.05）。这些观察表明UDCA可减轻SCI诱导的组织和全身炎症反应。
四、讨论与结论
研究人员在讨论部分指出，UDCA作为一种内源性胆汁酸，是参与肠-脑轴相互作用的代谢物类别，其现代纯化或合成制剂具有广泛的药理活性和良好的安全性。既往研究已证实UDCA在胸段SCI（T9）大鼠模型中可显著改善后肢运动功能恢复，本研究进一步在急性C5颈髓SCI模型中证实UDCA可改善前肢运动功能障碍，提示UDCA在不同节段SCI中均发挥神经保护作用并促进运动恢复。在机制层面，UDCA可能通过结合并激活G蛋白偶联胆汁酸受体TGR5（GPBAR1）来抑制NLRP3炎症小体组装和激活，从而减弱NLRP3-GSDMD介导的焦亡。研究人员注意到，UDCA主要抑制全长GSDMD的表达，从而限制可供Caspase-1切割的底物池，而非直接抑制已存在GSDMD蛋白的Caspase-1依赖性蛋白水解切割；由于N-GSDMD水平可能在SCI后3天内达到峰值，预先形成的片段在第7天仍可存留于脊髓实质中，这可能是N-GSDMD丰度在SCI组与SCI+UDCA组间无统计学显著差异的原因。此外，UDCA治疗降低损伤脊髓中Iba-1免疫反应性（提示小胶质细胞活化减少），并降低血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平，表明UDCA可同时减轻局部脊髓炎症和全身炎症反应。
研究结论：结合体外BV2小胶质细胞实验和体内动物评估，本研究揭示了UDCA干预与急性C5颈髓SCI模型中继发性损伤减轻及功能结局改善之间的关联。研究观察表明，UDCA治疗与LPS诱导的BV2小胶质细胞NLRP3表达降低相关；在急性C5颈髓SCI大鼠中，UDCA给药与前肢运动功能保留和脊髓组织病理损伤减轻相关。此外，研究数据表明UDCA治疗与NLRP3/Caspase-1/GSDMD级联活性改变相关，并伴随神经焦亡和神经炎症的减轻。综上所述，这些发现为UDCA的临床前应用潜力提供了实验依据，并可能支持针对急性颈髓损伤的进一步机制研究，对开发新型临床前干预策略具有重要意义。
