《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Comparative Physiological and Ecological Characterization of the Photosymbiotic Amoeba Mayorella viridis Across Symbiotic and Aposymbiotic States
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共生（symbiosis）是实现不同生物间代谢互补的基础性生物学策略。变形虫 *Mayorella viridis* 与绿藻 *Chlorella* 建立光合共生（photosymbiosis）关系，然而该关联的生理学基础仍知之甚少。本研究比较了共生（绿色）株
共生（symbiosis）是实现不同生物间代谢互补的基础性生物学策略。变形虫 *Mayorella viridis* 与绿藻 *Chlorella* 建立光合共生（photosymbiosis）关系，然而该关联的生理学基础仍知之甚少。本研究比较了共生（绿色）株系与无共生（白色）株系，以量化共生状态的表型效应。投喂条件下细胞大小无差异，但饥饿条件下白色株系细胞显著缩小，表明 *Chlorella* 在营养限制下有助于维持宿主稳定性。运动性不受共生状态影响。相反，包括正趋光性（positive phototaxis）与避光反应（photophobic response）在内的光反应在白色株系中完全丧失，证明共生 *Chlorella* 为宿主光反应所必需。在持续光照（constant light, CL）与持续黑暗（constant dark, CD）条件下，白色株系的生长与存活均显著降低，表明共生体同时增强宿主增殖能力与饥饿耐受性。值得注意的是，在黑暗及营养限制条件下，胞内 *Chlorella* 数量下降，提示其被消化并作为内部营养源加以利用。通过将分离的 *Chlorella* 重新导入无共生细胞，光合共生得以重建，绿色表型与光反应随之恢复。上述发现建立了一个可逆的实验体系，并阐明了光合共生在 *M. viridis* 中的生理作用。
**研究背景与问题** 光合共生（photosymbiosis）指光合微藻与不具光合能力的真核生物之间的共生关系，在海洋生态系统中珊瑚、海葵、水母等与甲藻及绿藻的共生已被广泛研究，淡水环境中的刺胞动物及多种原生生物（尤其纤毛虫）常以 *Chlorella* 作为胞内共生体。理解宿主与共生体的关系对于阐明质体通过次级及更高级内共生相互作用而建立的机制至关重要。脱共生（aposymbiosis）状态的实验性构建是此类研究的关键，已有多种方法被报道，并由此开展了海葵、绿水螅、纤毛虫等的转录组比较研究；绿草履虫 *Paramecium bursaria* 在重新导入分离共生藻后可重建共生，为研究共生整合的细胞机制提供了有力体系。变形虫门（Amoebozoa）缺乏鞭毛或纤毛等特化运动细胞器，而 *Mayorella viridis* 是胞质内携带 *Chlorella* 的淡水变形虫，目前该门中仅 *Mayorella viridis* 与 *Parachaos zoochlorellae* 两种已知参与光合共生；尽管具重要进化与生态意义，其共生建立、维持与调控的分子与细胞研究极为有限，仅有少数研究涉及共生藻的系统发育身份与宿主—共生体特异性。研究组此前通过靶向药物处理结合持续黑暗（CD）长期培养，成功从 *M. viridis* 去除内共生 *Chlorella* 并建立无共生株系，且可将分离的 *Chlorella* 导入无共生宿主以重建共生体系，从而建立了变形虫门中全球罕见的、可对共生与无共生状态进行可逆调控的实验模型。本研究利用该模型对携带 *Chlorella* 的绿色株系与实验获得的无共生株系进行比较生理与生态分析，旨在为今后探究光合共生建立与维持所需条件及宿主—共生体互作的分子水平研究提供基础数据。
**主要技术方法** 研究以 *Mayorella viridis*（由日本神户大学 Suzaki 博士提供）为材料，于 0.001% Knop 溶液、20°C、12:12 光周期下培养，每周两次投喂 *Chlorogonium capillatum* 作为食物。无共生株系通过吡哒嗪酮类除草剂 norflurazon（10–20 mg/L）处理 7 天并结合 CD 条件下带饵培养构建。共生重建时将绿色株系洗涤、冰上玻璃匀浆器匀浆、12,000 × g 离心 5 min 分离 *Chlorella*，与白色株系混合于 25°C、CL 条件下孵育 24 h，随后洗涤并在无饵 CL 条件下培养。采用光学显微镜、体视显微镜及配备 U-MWBV 滤光片组（激发 400–440 nm，发射 > 475 nm）的荧光显微镜观察 *Chlorella* 叶绿素自发荧光（AF）。实验均设五重复，以 Student's t 检验分析，p < 0.05 记为显著。
**研究结果**
**绿色与白色株系的比较分析** 通过微分干涉相差（DIC）与荧光显微镜观察到绿色株系胞内富含内共生 *Chlorella*，白色株系未见藻类共生体、亦无自发荧光信号，且回到 CL 条件后不恢复绿色，证实共生藻已被有效去除。
**细胞大小** 投喂条件下两株系无显著差异（绿色 4.3 ± 0.2 × 103 μm2；白色 4.2 ± 0.1 × 103 μm2）；饥饿条件下白色株系显著小于绿色株系（绿色 4.6 ± 0.1 × 103 μm2；白色 2.8 ± 0.1 × 103 μm2），提示内共生 *Chlorella* 与营养限制下宿主结构稳定性的增强相关。
**细胞运动性** 10 min 内移动距离在投喂（绿色 1.9 ± 0.1 mm；白色 1.8 ± 0.1 mm）与饥饿（绿色 2.3 ± 0.0 mm；白色 2.2 ± 0.2 mm）条件下均无显著差异，表明运动性不依赖共生状态。
**光反应** 将培养皿侧向照光并孵育 2 天，中等辐照度（11.5 μmol photons m?2 s?1）下绿色株系多数细胞迁移至最远端区域，表现避光反应，而白色株系随机分布；低辐照度（0.28 μmol photons m?2 s?1）下绿色株系大量聚集于光源附近，表现正趋光性，白色株系无此行为。结果表明共生 *Chlorella* 驱动绿色株系的正趋光与避光反应，且其光反应密切依赖共生藻的光合活性。
**生长与存活曲线** 投喂条件下，CL 时第 7 天绿色株系细胞数为 59 ± 6、白色为 43 ± 4；CD 时分别为 47 ± 5 与 26 ± 5，绿色株系增殖显著更快。无饵饥饿条件下，CL 时第 28 天白色株系降至 1.2 ± 1.0 个细胞，绿色株系维持 7.2 ± 0.7 个；CD 时第 28 天两株系无显著差异（绿色 2.0 ± 1.0；白色 0.2 ± 0.2），但中间时间点绿色株系存活显著更高（第 14 天 8.6 ± 0.9 对 3.8 ± 0.9；第 21 天 4.6 ± 1.7 对 0.4 ± 0.4）。为探究 CD 饥饿下增强的耐受机制，量化单个绿色株系细胞内共生 *Chlorella* 数目，由起始 407 ± 43 个逐渐下降，第 14 天后显著降低（255 ± 13），至第 28 天降至 127 ± 16。综合表明内共生 *Chlorella* 增强宿主增殖与饥饿耐受，并提示 CD 条件下共生藻可能被消化作为内部营养源。
**光合共生的重建** 将分离 *Chlorella* 导入白色株系后 6 天内，DIC 与自发荧光显示共生藻在宿主胞质内逐渐增多并最终充满宿主细胞；实验期间未投饵亦未补充 *Chlorella*，说明初始被摄入的少量藻细胞发生分裂增殖。重建绿色株系在投喂与饥饿条件下细胞大小分别为 4.5 ± 0.2 × 103 μm2 与 4.3 ± 0.1 × 103 μm2，与原绿色株系无显著差异，并对中等辐照度表现避光、对低辐照度表现正趋光。表明白色株系在光合共生重建后获得结构稳定性与光反应行为。
**讨论与结论** 研究组成功结合化学处理与 CD 长期培养去除共生藻。曾参照绿草履虫脱共生方法尝试 CD 长期培养、除草剂 paraquat、光合抑制剂 DCMU 及蛋白合成抑制剂 cycloheximide，但部分条件下 *Mayorella* 保留共生藻，部分条件下仅暂时减少并部分消除，恢复投喂与 CL 后 *Chlorella* 重新增殖并恢复绿色表型；其他光合抑制剂（oxyfluorfen）、纤维素合成抑制剂（dichlobenil）及杀藻剂亦未能完全消除共生藻。多数光合抑制剂无法完全消除共生藻，提示共生藻的光合活性可能并非维持 *Mayorella* 光合共生体系的必需条件，这与既往报道一致；而 quinoclamine（ACN）曾在 *Mayorella* 与 *Hydra* 中成功消除共生藻，本研究中 norflurazon 同样为例外并最终成功建立无共生株系。这些化合物虽常含芳环或卤素原子，但光合抑制机制不同，提示宿主物种或株系及共生藻株系的差异可能导致对 CD 与化学处理敏感性的差异。比较分析表明，共生 *Chlorella* 增大宿主细胞、赋予光反应性、在营养丰富时促进增殖、在营养贫乏时增强饥饿耐受，并可能作为内源营养资源。细胞大小方面，白色株系在营养丰富（4.2 ± 0.1 × 103 μm2）与贫乏（2.8 ± 0.1 × 103 μm2）条件间差异显著，可能归因于对猎物 *Chlorogonium* 捕食增加及食物泡形成；绿色株系则无显著差异（4.3 ± 0.2 与 4.6 ± 0.1 × 103 μm2），提示含共生藻的绿色株系即使营养丰富也形成少量食物泡、捕食活动受抑，而 CL 营养丰富时绿色株系增殖率更高，暗示共生藻光合产生的能量贡献大于捕食所得能量。CL 饥饿条件下白色株系约 1 个月内几乎全部消亡，绿色株系约 70% 存活，与 Yamagishi et al.（2025）报道一致，其存活提升可能归因于共生藻光合供能；分子层面已在多种光合共生生物中证实麦芽糖、葡萄糖等光合产物由共生体转移至宿主，*Chlorella* 光能转换效率高，营养转移可能比捕食获取能量更高效。白色株系完全丧失光反应性，而光合共生生物的光行为已知依赖共生体光合活性；绿色株系在弱光下正趋光、强光下避光，提示 *Mayorella* 通过主动迁移至最适光环境来平衡光合收益与氧化应激风险。CD 生长实验中绿色株系仍增殖更快，黑暗中维持共生藻对宿主有成本，这种优势可能来自消耗实验前共生藻积累的光合产物；但仅靠储存产物难以维持长达 1 个月的能量需求，故量化 CD 饥饿下共生藻数目，发现第 14 天后显著下降，提示绿色株系消化共生藻作为内源营养资源以获得高饥饿耐受，类似现象见于深海贻贝、造礁珊瑚与纤毛虫；CD 生长比较中绿色株系的高增长率亦可能源于共生藻消化，但该实验在投喂条件下进行，难以区分摄入猎物与胞内共生藻，故未能定量评估共生藻数量变化。此外，通过将白色株系与分离 *Chlorella* 混合成功再生绿色株系，提示共生体传播的可能途径：长期培养中常见游离 *Chlorella*，可能由活宿主释放或源自破裂宿主细胞，随后被无共生宿主摄入而重建光合共生。重建绿色株系细胞大小（投喂 4.5 ± 0.2 × 103 μm2；饥饿 4.3 ± 0.1 × 103 μm2）与原绿色株系相当，并表现正趋光与避光两种光行为，光反应性的获得强烈提示共生 *Chlorella* 的光合活性直接影响宿主 *Mayorella* 的生理与生态。未来鉴定与定量宿主—共生体间交换的代谢物及转运相关膜蛋白与基因集的功能分析，将进一步深化对光合共生体系建立与稳定维持分子基础的理解。最后，白色株系与 *Chlorella* 共生后恢复绿色表型并获得光反应性虽不能直接重现以叶绿体获得为代表的内共生进化过程，但表明类似内共生进化早期的现象可被实验操控，具有重要意义；该模型体系由共生绿色株系、无共生白色株系及分离 *Chlorella* 组成，可实验控制光合共生的建立，对研究光合共生起源与维持的分子机制极具价值；尽管共生与非共生状态的可逆循环已以绿草履虫为模型广泛研究，仍需多样且实验上可操作的模型以识别这一基本进化过程的共有与谱系特异性机制，*Mayorella* 因而成为研究光合共生关系建立与维持的有价值补充模型体系。
研究结论（译）：上述发现建立了一个可逆的实验体系，并阐明了光合共生在 *M. viridis* 中的生理作用。
