**解剖学网络分析揭示无尾目变态前后颅骨系统支持适应性解耦假说**

《Journal of Morphology》：Anatomical Network Analyses of Pre- and Post-Metamorphic Cranial Systems Support the Adaptive Decoupling Hypothesis in Anura

　　

以变态（metamorphosis）连接不同生活阶段的复杂生活史（complex life cycle）引发如下问题：这些不同生活阶段的性状能否独立演化，抑或保持演化上的耦合。由于变态可包含生活阶段之间的性状重组，适应性解耦假说（adaptive decoupling hypothesis，ADH）提出，幼体与成体性状可能 largely 独立演化。在无尾目（Anura）中，颅骨系统在变态期间经历重大重组，由独特的软骨性幼体颅骨转变为骨化成体颅骨，然而这一转变从未在跨物种层面得到定量刻画。研究人员将解剖学网络分析（Anatomical Network Analysis，AnNA）应用于具有不同摄食与发育模式的幼体与成体无尾类的颅骨肌肉骨骼系统。AnNA描述颅骨的拓扑组织，无需同源标志点（homologous landmarks），从而允许比较形态上差异显著的系统。研究人员计算了描述整合（integration）与模块化（modularity）的拓扑参数，以及各颅骨网络内的连接模块（Q-modules）。作为该分析的一部分，研究人员对幼体与成体 *Smilisca phaeota* 的颅骨肌肉骨骼系统作了扩展的形态学描述。幼体与胚胎颅骨在拓扑上高度整合且模块化程度较低，而成体颅骨整合程度较低并组织为彼此分明的模块。因此，幼体与成体生活阶段占据拓扑形态空间（topological morphospace）中的不同区域，其中内营养型（endotrophic）无尾类的幼体与胚胎尽管缺乏自由生活的幼体阶段，仍一致地聚集于幼体拓扑空间内。总之，这些发现支持无尾目各生活阶段颅骨系统的适应性解耦假说。

**研究背景与问题**　许多动物具有由两个或以上胚胎后生活阶段构成的间接或复杂生活史（Raff 2008），这些阶段在形态、生理、生态与行为上常存在深刻差异，并由变态这一深刻转变过程相连（Ebenman 1992；Moran 1994；Wilbur 1980）。变态期间众多形态、生理、行为与生态特征的转变，可能使各生活阶段分别适应不同的选择压力，由此形成适应性解耦假说（ADH），即复杂生活史中不同生活阶段的性状可 largely 独立演化（Istock 1967；Moran 1994）。无尾目是检验该假说的理想对象：其高度特化的幼体——蝌蚪——适应水生杂食生活（Monta?a et al. 2019），具完全软骨性颅骨与由可动的前吻软骨、相关肌肉及角质喙构成的独特幼体颌器；摄食依赖角鳃骨（ceratohyal）旋转使口腔底部升降产生泵流，角质喙与唇齿刮食基质上的藻类、生物膜与死有机质（Altig et al. 2007；Wassersug and Hoff 1979）。无尾目在蝌蚪形态、摄食模式与栖息地上高度多样，可能促成其相对于蚓螈目与有尾目的广泛分布与物种丰富（Altig and Johnston 1989；Sherratt et al. 2018）。变态常伴随水生向陆生的转变，蝌蚪完全重塑：四肢生长分化、尾与鳃丧失、颅骨与摄食器官由幼体口器改造为成体捕食性咬合颌（Altig et al. 2007；Duellman and Trueb 1994；Wassersug 1975）。除祖生的外营养型（exotrophy）间接发育外，无尾目还具陆生卵、内营养型（endotrophy）乃至直接发育等多种繁殖与发育模式（Altig and Johnston 1989；Liedtke et al. 2022），由此提出变态是否允许蝌蚪与成体性状相对独立演化的问题。然而，支持ADH的证据并不一致：体型、行为及体型与运动的遗传基础在生活阶段间存在相关（Blouin 1992；Dehling and Sinsch 2019；Phung et al. 2020；Watkins 2001），但多数研究支持生活阶段在体形（区别于体型）与运动性状上一定程度独立演化（Almeida-Silva and Vera Candioti 2024；Blouin 1992；Johansson et al. 2010；Phillips 1998；Phung et al. 2020；Sherratt et al. 2017；Wollenberg Valero et al. 2017）。颅骨及相关肌肉参与呼吸、摄食及成体发声交流等经历深刻变态变化的性状（Duellman and Trueb 1994），但两个生活阶段形态组织差异（成体具骨性成分而蝌蚪颅骨多为软骨）及同源标志点不足，使跨阶段的定量比较十分困难。解剖学网络分析（AnNA）通过量化骨骼单元（节点）及其连接（连线）的拓扑复杂性与整合以及整个颅骨系统的模块化，使比较变态前（蝌蚪/胚胎）与变态后（“成体”）颅骨肌肉骨骼系统的组织（拓扑）成为可能，并可识别具有生物学意义的连接模块（Q-modules）（Rasskin-Gutman and Esteve-Altava 2014；Rawson et al. 2022；Werneburg et al. 2019）。为此，研究人员检验幼体与成体颅骨拓扑分析能否支持无尾目的ADH：首先研究水生间接发育的新格拉纳达十字带树蛙 *Smilisca phaeota*（Cope 1862）变态前后的颅骨肌肉骨骼拓扑，并提供蝌蚪与变态后阶段的详细颅骨解剖描述；继而基于这些解剖数据实施常规AnNA，并另作一项纳入颅骨结构发育起源潜在影响的分析；随后将分析扩展至6科（Ascaphidae、Bombinatoridae、Pipidae、Eleutherodactylidae、Alsodidae与Hylidae）共9种无尾类，检验 *S. phaeota* 的结果能否代表不同幼体摄食与发育模式的无尾类，并考察内营养型发育模式（陆生蝌蚪或直接发育）物种的变态前后生活阶段是否较外营养型蝌蚪物种聚得更近。

**材料与方法概要**　研究材料包括私人饲养者提供、2016年按德国《动物保护法》§11于耶拿Friedrich-Schiller大学动物学与演化研究所饲养的 *S. phaeota* 幼体与成体（以1%三卡因甲磺酸盐MS-222处死、4%磷酸缓冲福尔马林固定、70%乙醇保存，幼体分期依Gosner 1960）；另从文献及MorphoSource扫描获取6科成体及其对应幼体或胚胎数据（Blackburn et al. 2024），变态前拓扑取自高达Gosner 39期（均值Go 32）的蝌蚪颅骨描述，*S. phaeota* 幼体骨骼拓扑补充自Ziermann-Canabarro and Lukas（2024），含肌肉连接的拓扑基于本研究描述；*Eupsophus roseus* 成体拓扑与近缘种 *E. calcaratus*、*E. emiliopugini* 蝌蚪拓扑比较（Vera Candioti et al. 2005, 2011），*Eleutherodactylus coqui* 成体拓扑与发育阶段TS 11胚胎拓扑比较（Townsend and Stewart 1985）。关键技术方法包括：（1）X射线显微成像与三维重建——标本经2%磷钨酸对比数日，以Zeiss XRadia Versa 410扫描（成体60 kV、8 W、曝光11 ms、像素29.474 μm；蝌蚪60 kV、8 W、曝光3 ms、像素7.3751 μm），tiff图像栈以Fiji处理，以Amira 2021.2重建（成体n = 2，蝌蚪n = 1），术语依Duellman and Trueb（1994）与Haas（2003）；（2）解剖学网络分析——以邻接矩阵构建无权无向网络，节点代表骨骼结构，连线代表缝、关节、肌肉与韧带接触，以R 4.5.2、RStudio 2025.09.2及igraph包计算节点数（N）、连线数（K）、连接密度（D）、聚类系数（C）、平均最短路径长度（L）、异质性（H）与分区度（P），并对每物种每阶段构建常规“拓扑分析”与按软骨化中心定义节点的“发育-拓扑分析”两套矩阵；（3）Q模块分析——基于广义拓扑重叠相似矩阵（GTOM）层次聚类，以模块度Q优化识别模块，Qmax低于0.3视为无显著模块化，并以jackknife估计误差、单侧Wilcoxon秩和检验评估模块显著性；（4）主成分分析（PCA）——对五项拓扑参数（排除N与K以减轻网络大小影响）作PCA，并以vegan包adonis2函数实施10,000次重复的PERMANOVA检验阶段间差异；（5）生活史阶段间拓扑相似性分析——计算基于网络参数的成对欧氏距离矩阵，比较幼体与其对应成体距离（dLA）及与其他幼体平均距离（dLL），以Wilcoxon符号秩检验单侧检验。

**研究结果**　3.1 变态前后 *Smilisca phaeota* 的颅骨肌肉骨骼解剖：依据Ziermann-Canabarro and Lukas（2024）简述Gosner 26–27期软骨颅（最大宽度位于肌突与眶下杆中部，成对粗壮上前吻软骨于中线相接成U形并与小梁角关节，小梁角约占软骨颅全长四分之一，耳囊背侧由大软骨桥相连，腭方软骨经宽大的方颅连合、升突与短耳突附着于脑颅，麦克尔软骨呈逗号形，鳃弓骨中角鳃骨长并具弯曲前突，四对角鳃骨粗壮且多突起，仅第三连合清晰可辨），鉴定出40块颅部肌肉；并描述成体颅骨（头宽大于长，宽长比约1.3，最宽处位于上颌骨与方轭骨缝；额顶骨完全愈合且具强眶上突；鳞骨大；犁骨于中线相接；腭骨内侧接触蝶筛骨；翼骨大；下颌主要由夹板骨构成；舌器软骨板宽约为长四倍，具骨化角鳃骨后突；鉴定出41块肌肉）。3.2 *S. phaeota* 颅骨拓扑的变态变化：两种网络分析均揭示变态期间可比的组织变化，但拓扑网络参数变化更显著；变态后节点与连线数增加，连接密度与聚类系数下降，平均最短路径长度增加，成体异质性更高（前耳骨为连接脑颅、舌器与悬器的枢纽，其次为蝶筛骨与夹板骨）；模块化随变态增加（成体拓扑网络6个Q模块，发育-拓扑分析中蝌蚪5个、成体7个模块），蝌蚪拓扑网络未达显著模块化（Qmax = 0.21）。3.3 无尾目变态过程中的颅骨拓扑：将分析扩展至 *Ascaphus truei*、*Bombina orientalis*、*Hymenochirus boettgeri*、*Xenopus laevis*、*Eleutherodactylus coqui* 与 *Eupsophus*，各分类单元变态变化大体相似，且拓扑网络中的阶段差异较发育-拓扑网络更明显。3.4 拓扑网络的变化：成体网络含更多节点与连线，蝌蚪/胚胎具更高连接密度与聚类系数而成人具更高平均最短路径长度与异质性，前耳骨与夹板骨在几乎所有类群中充当枢纽，蝶筛骨在若干物种亦然；GTOM未在所有蝌蚪/胚胎及所有 *X. laevis* 成体拓扑网络中检出显著模块化，成体平均恢复5.7个Q模块，大体对应前、后脑颅、成对悬器、舌器与颌；PCA将成体与幼体/胚胎拓扑分入显著不同的形态空间区域（PERMANOVA：F (1,13) = 30.749，p = 0.0003，PC1解释81.4%差异），Wilcoxon符号秩检验表明幼体间及成体间的相似性显著高于与对应阶段的相似性（V = 36，p = 0.007）。3.5 发育-拓扑网络的变化：模式与拓扑网络大体一致（*A. truei* 例外，连线随变态减少），聚类系数反映物种差异而非变态变化，异质性除 *Eleutherodactylus* 外均升高，分区度增加；成体平均6.4个模块、蝌蚪/胚胎4.75个，幼体模块组织种间变异大且边界不一致（角鳃骨分别与鳃篮、脑颅或颌模块关联或自成模块）；PCA同样显著分离两阶段（PERMANOVA：F (1,13) = 11.176，p = 0.0004，PC1解释60.6%），Wilcoxon检验示幼体/胚胎V = 36，p = 0.007，成体V = 33，p = 0.021。

**讨论与结论**　讨论指出：AnNA通过分析解剖系统内部连接探究整合与模块化，使比较差异显著的解剖系统与个体发育差异成为可能。4.1 节指出 *S. phaeota* 变态以颅骨拓扑重组与模块化变化为特征，连接密度下降而平均最短路径长度与分区度上升，表明拓扑复杂性与整合下降、模块化强烈增加，反映栖息地类型转变及摄食与呼吸模式的相应改变；模块在演化发育生物学中被视为紧密整合、彼此松散连接的单元，连接模块化可能反映共同发育起源或功能组合，须事后重新评估其生物学解释力，如 *Hymenochirus* 幼体舌鳃器与角鳃骨分明的形态学证据在本研究发育-拓扑网络中独立重现；与172种成体无尾类颅骨形态测量协变分析相比，AnNA识别出由方轭骨、翼骨与夹板骨构成的类似悬器模块，但两种方法因方法学差异（协变分析基于跨物种形态变化与直接接触，Q模块纳入骨关节、韧带与肌肉连接而不含形态）模块组成不同，显示二者互补；幼体模块高度可变（尤其角鳃骨关联不一致），可能为节点数少所致的方法学假象、蝌蚪颅骨普遍缺乏模块化或分类单元特有的摄食与繁殖模式差异，*H. boettgeri* 中角鳃骨与颌关联可能反映捕食性摄食模式，内营养型物种亦然；变态中连接模块数总体增加，但 *A. truei* 成体与幼体均为四模块，可能与成体骨化程度低相关；幼体拓扑网络无显著模块化可能因蝌蚪颅骨作为高度整合单元发挥功能与演化，也可能部分反映方法学局限（节点少时社区检测低估模块化，且AnNA未计入连接类型与数目）。4.2 节指出两种AnNA均揭示独立于幼体摄食模式的变态期拓扑重组，虽具体变化不同但均清晰区分变态前后颅骨系统；成体与幼体/胚胎各自占据拓扑形态空间特定位置，外营养型刮食者 *B. orientalis* 与内营养型 *E. calcaratus* 拓扑意外接近，幼体颅骨形态差异大可能与其单一结构高度整合、倾向整体演化变化有关；内营养型物种发育呈个体发育重排的镶嵌，*Eupsophus* 陆生蝌蚪似保留外营养祖先的颅骨拓扑，直接发育类变态并未丧失而是在胚胎期更渐进地发生，其颅骨与肌肉骨骼性状在变态高峰减缩至类似外营养蝌蚪的状态；内营养型胚胎/幼体在拓扑形态空间中与外营养型紧密聚集，可能反映二者均为高度整合系统（功能整合或发育过程）。4.3 节将无尾目变态前后颅骨拓扑的清晰区分解释为对ADH的支持：蝌蚪颅骨高度整合、低模块化可能反映摄食与呼吸的紧密耦合，单个骨骼元件的变化倾向影响整个系统，可能驱动幼体摄食模式多样化及变态前颅骨的高形态差异；成体颅骨高模块化允许各模块相对独立特化，可能促进独特摄食机制（如Pipidae水生吸食）的演化，并可能与感觉器官及活动模式、栖息地利用的转变协同演化，从而支持无尾目多样化；有尾目颅骨与下颌形态测量亦支持ADH，而体形与脊柱多样化研究显示阶段间相关，无尾目的证据较模糊，但文献总体支持在形态遗传基础、运动性状与体形变化上的适应性解耦，说明解耦作用于个别性状而非整个生活阶段。结论部分译文：本研究提供幼体与成体 *Smilisca phaeota* 颅骨肌肉骨骼系统的形态学描述，并应用解剖学网络分析（AnNA）量化变态期间颅骨拓扑的变化，通过考察颅骨系统的组织补充了既有形态测量分析（Bardua et al. 2020）。拓扑与发育-拓扑分析均揭示所有受检物种一致的变态变化，其中拓扑分析恢复更显著的拓扑位移。蝌蚪颅骨以高度整合与低模块化为特征，而成体颅骨模块化程度明显更高。在不同摄食与发育模式物种中观察到的生活阶段间拓扑区分，支持无尾目颅骨系统在个体发育中的适应性解耦。本研究结果强化了如下观点：变态使幼体与成体性状得以 largely 独立演化，并使各生活阶段形成特化的适应。