用于三阴性乳腺癌联合治疗与MRI的多功能可生物降解纳米颗粒

《Materials Today Nano》：Multifunctional biodegradable nanoparticles for combined therapy and MRI of triple-negative breast cancer

　　

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）因其侵袭性强、复发风险高及治疗选择有限，仍是一项重大治疗挑战。当前临床管理高度依赖化疗，包括蒽环类药物与紫杉烷类，常联合免疫治疗、手术和/或放疗。然而，化疗常伴随全身毒性及化疗耐药性的产生，进而导致肿瘤复发与不良临床结局。因此，能够增强化疗疗效同时降低所需药物剂量的治疗策略极具价值。磁热疗（magnetic hyperthermia therapy, MHT）作为化疗的潜在辅助手段受到关注，因为升温可直接诱导癌细胞死亡并增强化疗药物效应。特别是，磁热疗可通过磁性纳米颗粒（nanoparticles, NPs）在交变磁场下暴露实现局部产热。与依赖近红外（near-infrared, NIR）照射的光热治疗相比，MHT具有更深的组织穿透能力，且无需对肿瘤进行直接光学接触。然而，开发兼具充分磁热加热能力、生物相容性与可生物降解性的MHT纳米平台仍具挑战。氧化铁NPs是MHT研究最广泛的材料之一，因其合成成熟、生物相容性好及磁学性质优良。但其降解相对缓慢可能引起对长期滞留和生物蓄积的担忧，而其高铁含量可能导致不良氧化效应。因此，铁掺杂磷酸钙（iron-doped calcium phosphate, FeCaP）NPs被提出作为替代磁性平台，结合了磷酸钙的可生物降解性与生物相容性以及可调控的铁掺入。尽管具有这些优势，FeCaP NPs在MHT方面的研究仍较少，且其胶体稳定性可限制其用于全身给药的发展。除材料相关挑战外，肿瘤细胞对热的生物学响应也可限制MHT疗效。热休克蛋白（heat-shock proteins, HSPs），尤其是HSP70和HSP90，作为分子伴侣保护细胞免受热诱导的蛋白质损伤，进而可降低热疗的治疗效果。将MHT与化学动力学治疗（chemodynamic therapy, CDT）联合是克服该局限的潜在策略。CDT利用过渡金属通过Fenton或类Fenton反应催化将内源性过氧化氢（H₂O₂）转化为高活性羟自由基（•OH），从而诱导肿瘤细胞氧化损伤。重要的是，MHT产生的升温可增强这些反应动力学，提供MHT与CDT之间的潜在协同作用。然而，CDT疗效强烈依赖于肿瘤微环境中H₂O₂的可利用性。增加H₂O₂可利用性的一种方法是引入葡萄糖氧化酶，其可将葡萄糖转化为H₂O₂。虽有效，但酶基系统增加了制剂复杂性并可能引入额外转化障碍。另一种策略是利用化疗药物的内在特性。阿霉素（doxorubicin, DOX）是一种广泛用于TNBC治疗的蒽环类药物，主要通过DNA嵌入和拓扑异构酶II抑制诱导细胞毒性。重要的是，DOX还可参与氧化还原循环并通过NADPH依赖机制促进H₂O₂生成，为类Fenton反应提供潜在底物来源。因此，将DOX与含铁磁性纳米材料结合提供了在同一平台整合化疗与CDT的机会，而MHT可进一步增强两种治疗机制。基于此原理，本工作开发可生物降解磁性FeCaP NPs作为多功能平台，用于同时递送DOX并联合化疗、CDT与MHT，并具有磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）对比剂的额外潜力。所提出的系统整合了各组分的互补功能：磷酸钙提供可生物降解基质，铁实现磁热加热与类Fenton催化活性，DOX提供化疗活性与潜在H₂O₂来源。因此，该设计旨在建立单一可生物降解纳米平台，使化疗、CDT与MHT相互关联，同时提供基于MRI的成像能力。据研究人员所知，这些功能在FeCaP NPs中的组合此前未见报道，使该平台成为传统氧化铁基磁性纳米材料的潜在可生物降解替代方案。

**研究背景与问题提出**

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）因侵袭性强、复发风险高、治疗选择有限，仍是临床重大难题。现有治疗以蒽环类与紫杉烷类化疗为主，常联合免疫治疗、手术和/或放疗，但化疗易产生全身毒性与耐药，导致复发和预后不良。因此，亟需能在降低药物剂量的同时增强化疗疗效的策略。磁热疗（magnetic hyperthermia therapy, MHT）借助磁性纳米颗粒（nanoparticles, NPs）在交变磁场下局部产热，组织穿透深且无需光学接触，可作化疗辅助；氧化铁NPs虽研究广泛，但降解缓慢、易蓄积，且高铁含量可能带来不良氧化效应。铁掺杂磷酸钙（iron-doped calcium phosphate, FeCaP）NPs兼具磷酸钙的可降解性与可调铁掺入，但在MHT领域研究稀少且胶体稳定性不足。另一方面，热休克蛋白（heat-shock proteins, HSPs）可保护肿瘤细胞抵御热损伤而削弱MHT疗效；化学动力学治疗（chemodynamic therapy, CDT）利用铁经Fenton或类Fenton反应将H₂O₂转化为羟自由基（•OH），且升温可加速该反应，但CDT受限于肿瘤微环境中H₂O₂不足。阿霉素（doxorubicin, DOX）除DNA嵌入与拓扑异构酶II抑制外，还可经NADPH依赖机制促进H₂O₂生成，从而为CDT供底物。基于此，研究人员设计可生物降解磁性FeCaP NPs，同时负载DOX，整合化疗、CDT与MHT，并探索磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）对比能力。

**主要技术方法**

研究人员以共沉淀法在聚丙烯酸（polyacrylic acid, PAA）稳定下合成FeCaP NPs，经吸附法负载DOX；采用X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱、X射线衍射（XRD）、透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）与电泳光散射（ELS）表征理化性质；以邻苯二胺（TMB）氧化法、亚甲基蓝（MB）降解及电子顺磁共振（EPR）评价类过氧化物酶活性与•OH生成；用超导量子干涉仪（SQUID）与3 T临床扫描仪评价磁性与T₂加权MRI；以交变磁场测比吸收率（SAR）与本征损耗功率（ILP）；体外采用MDA-MB-468 TNBC细胞、人真皮成纤维细胞（HDF）与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）；血液相容性用人血沉棕黄层来源红细胞与人血浆（伦理批件90/19）。

**研究结果**

3.1 理化性质：XPS证实NPs含Ca、Fe、P、O、C，Fe 2p分峰确认Fe³⁺与Fe²⁺共存；FTIR与拉曼显示PO₄及PAA特征峰，拉曼633–748 cm^-1提示FePO₄振动；XRD仅见低结晶度羟基磷灰石相；TEM示针状NPs约98 ± 17 nm；DLS约95 nm，PDI约0.2；FeCaP与FeCaP@DOX的Zeta电位分别为-16 ± 0.3 mV与-14 ± 0.3 mV。

3.2 载药、释放与降解：吸附法载药效率约95%，载药量随初始药浓由5%增至10%；释放符合一级动力学，pH 7.4、6.0、5.0分别释放45%、80%、96%；72 h铁释放分别为20%、50%、85%；24 h内粒径随pH下降而变化，提示pH依赖降解。

3.3 类过氧化物酶性质与•OH产生：TMB氧化随H₂O₂浓度升高而增强，Michaelis-Menten曲线证实类酶行为，Vmax较高、Km较低，归因于PAA稳定Fe²⁺；活性随酸性增强、随温度升至45 °C升高；MB降解与EPR证实•OH生成且随温度增强。

3.4 磁性、MRI与磁热：NPs呈超顺磁性，饱和磁化强度4.6 emu g^-1；T₂加权成像呈浓度依赖对比，置于肌肉组织内仍显影，横向弛豫率R₂ = 3 × 10^-4 mL mg^-1 s^-1；升温呈浓度与频率依赖，至少升温10 °C，SAR与ILP随浓度升高而下降，334 kHz下安全值7.35 × 10⁸ A m^-1 s^-1介于Atkinson-Brezovich与Hergt限值之间。

3.5 细胞相容性、靶向、血液相容性与蛋白吸附：TNBC细胞存活率虽>70%但呈浓度依赖下降约20%，呈细胞静止效应；健康细胞无显著变化；活/死染色相符；静磁场下细胞内铁显著增加，荧光示4 h内摄取增多；两种制剂溶血率<5%但具明显促凝性；BSA吸附<10%。

3.6 体外抗癌活性：单疗中，CDT在pH 6.0与H₂O₂条件下72 h使存活率下降73%，pH 7.4仅50%，DCFDA荧光证实ROS增多；化疗呈剂量与时间依赖，48 h后IC₅₀显著降低，NPs较游离DOX在细胞内滞留更久；MHT（334 kHz，30 min）单次暴露使存活率下降50%，单独磁场无显著影响。双疗中，FeCaP@DOX优于游离药，模拟肿瘤条件下降低74%，未外加H₂O₂时24 h即降低87%。三疗中，化疗+CDT+MHT使存活率下降98%；Bliss独立分析预测存活10.33%，实测2.00%，Bliss超额8.33 ± 0.33个百分点，提示协同。

**讨论与结论**

讨论指出，PAA既提高胶体稳定性又抑制铁氧化，保留Fe²⁺/Fe³⁺结构而增强催化；FeCaP NPs对癌细胞的固有活性归因于钙超载，铁掺入不损害健康细胞，因氧化应激仅在高H₂O₂肿瘤环境中发生；促凝性源于铁离子激活凝血因子XII，可通过亲水涂层（如聚乙二醇基聚合物）改善；磁靶向需体内验证；横向弛豫率较低限制转化，可通过提高铁含量改善；三疗协同可能来自热疗阻断耐药、CDT抑制HSP促热敏化及DOX供H₂O₂的循环，但HSP表达机制仍需研究。

结论译文：本工作报道了pH敏感、可生物降解的铁掺杂磷酸钙NPs的合成，用于包括化疗、CDT与MHT在内的抗癌联合治疗。这些NPs实现了DOX的高效负载（95%）及受控释放，并表现出归因于钙超载的天然选择性抗癌活性，同时对健康细胞具有细胞相容性。然而，尽管无溶血性，FeCaP NPs具有促凝性，限制了其直接作为静脉系统应用，未来可通过亲水涂层解决。此外，磁靶向虽有前景，但需体内验证。在治疗潜力方面，载药NPs可通过标准化疗杀伤TNBC细胞；CDT主要在肿瘤模拟条件（酸性pH与H₂O₂升高）下降低癌细胞存活率；MHT以浓度与场频依赖方式产热并足以诱导癌细胞死亡。更重要的是，三疗联合单次应用即导致98%的癌细胞死亡，归因于协同效应。此外，由于超顺磁性，FeCaP NPs即使在生物组织内也可产生T₂加权MRI对比。尽管仍需体内验证，本研究证实的假设表明FeCaP NPs可作为基础材料，在单一可生物降解材料中整合多种癌症治疗与诊断潜力，并有望拓展至其他侵袭性实体瘤。