全转录组测序揭示胆母细胞型胆管癌的GATA4-INHA转录程序及起源祖细胞

《Modern Pathology》：Whole Transcriptome Sequencing Reveals a GATA4- INHA Program and Progenitor Cell of Origin in Cholangioblastic Cholangiocarcinoma

摘要专业翻译 胆母细胞型胆管癌（cholangioblastic cholangiocarcinoma，CBCA）是一种罕见的肝胆肿瘤，以NIPBL::NACC1基因融合为特征。其起源细胞及命名尚未明确，部分研究者倾向于将其重新分类为融合基因阳性的肝癌（hepatic carcinoma），而非一种独特的胆管癌亚型。研究人员采用全转录组测序（whole transcriptome sequencing，WTS）以界定CBCA相对于其他肝胆恶性肿瘤的转录程序及分化状态。研究共对来自多机构的334例肝胆肿瘤进行了WTS，涵盖8个诊断类别，包括10例CBCA和163例肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）。研究人员进行了聚类分析、差异表达分析、基因集富集分析、免疫细胞反卷积分析及起源细胞分析，并在独立队列（445例）中验证了GATA4免疫组织化学结果。NIPBL::NACC1融合基因在全部10例CBCA中检出，而在其余324例肿瘤中均未检出。诊断类别解释了转录组变异的52.7%（p=0.001），CBCA形成一个独立聚类，尽管基因水平重叠有限，其位置最接近iCCA，且其差异表达基因数目（n=1,451）多于任何其他类别（其他类别合计亦不及）。GATA4表达上调（log2FC=3.23，p<0.001），33个GATA4靶基因中有14个上调，其中INHA变化倍数最大，与6/6例CBCA中GATA4蛋白过表达、2%的iCCA中表达及278例肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中零表达相对应。突触和神经内分泌程序为富集程度最高的通路，起源细胞分析将CBCA定位于中间胆管祖细胞状态，其双潜能指数（Bipotency Index）为所有类别中最高（p≤0.001），且呈现近乎完全的免疫排斥。综上，这些发现界定了NIPBL::NACC1下游的GATA4-INHA转录程序，该程序解释了CBCA的抑制素A（inhibin A）免疫表型。这一胆管祖细胞状态支持“胆母细胞型”命名而非肝细胞癌起源，并在蛋白水平上通过GATA4免疫组织化学得到证实。

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一、研究背景与问题

胆母细胞型胆管癌（cholangioblastic cholangiocarcinoma，CBCA）是一种罕见的肝胆系统肿瘤，最初于2005年以“表达抑制素的肝腺癌”个案报道形式出现，2017年被正式描述并命名为“肝内胆管癌胆母细胞型变异”。该肿瘤具有一系列特征性形态学与免疫表型：好发于无基础肝病的年轻女性，呈实性小梁状和管囊状结构（类似甲状腺滤泡），细胞大小不一，可见较大的细胞和较小的“胚芽样”（blastemal-like）细胞，神经内分泌标志物呈一致性阳性（易被误诊为高分化神经内分泌肿瘤），免疫组织化学显示胆管分化（细胞角蛋白7和19阳性、Hep-Par1阴性）而非肝细胞分化，且抑制素A（inhibin A）呈强弥漫性阳性。2021年，研究者发现NIPBL::NACC1基因融合是CBCA的特征性分子改变，此后陆续有约20例经遗传学确诊的病例报道。

然而，CBCA的发病机制和起源细胞始终未获解决，其命名亦存在争议。部分研究者基于CBCA缺乏传统胆管癌的驱动基因突变（如ARID1A、TP53、IDH1、FGFR2、BAP1和KRAS），以及认为CK7和白蛋白原位杂交阳性不足以证明胆管分化，提议将其重新命名为“NIPBL::NACC1融合肝癌”（hepatic carcinoma）；另有研究者提出“实性-管囊状肝内胆管癌变异型”的名称。这些争议无法仅凭形态学和免疫组织化学解决，因为不同研究者从重叠的形态和免疫表型数据中得出了相反的结论。NIPBL::NACC1融合对CBCA转录程序、细胞分化状态和通路活性的分子后果此前从未被系统表征，该肿瘤的发病机制缺乏分子框架。解决这些问题需要对CBCA与已确立的肝胆肿瘤类型（包括肝内和肝外胆管癌、肝细胞癌、胆囊癌）进行系统转录组比较，以确定CBCA在肝胆恶性肿瘤分子图谱中的位置，以及其转录组分化谱是否支持胆管祖细胞起源或替代性起源细胞。全转录组测序（whole transcriptome sequencing，WTS）可同时捕获差异基因表达、融合转录本结构、基因集富集、免疫微环境组成和细胞类型分化特征，是解决这一争议的合适平台。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员对来自多个机构的334例原发性肝胆肿瘤进行了WTS，涵盖8个诊断类别：CBCA（10例）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA，163例）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，72例）、胆囊癌（gallbladder carcinoma，GBCA，46例）、肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，eCCA，33例）、肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB，6例）、肝腺瘤（hepatic adenoma，HA，2例）和混合型肝细胞-胆管癌（mixed HCC-CCA，2例）。标本来自匹兹堡大学医学中心、约翰斯·霍普金斯医院、斯坦福大学医院和塔塔纪念中心，涵盖139例手术切除（42%）和195例活检（58%）标本，时间跨度为2021年至2025年。主要技术方法包括：WTS及生物信息学分析（STAR比对、featureCounts定量、ComBat批次效应校正）；主成分分析（PCA）和UMAP降维可视化；置换多元方差分析（PERMANOVA）和轮廓分析量化聚类分离度；Welch双样本t检验和Benjamini-Hochberg校正进行差异表达分析；五工具共识流程（STAR-Fusion、ChimeraScan、FusionCatcher、DRAGEN和Pizzly）鉴定融合转录本；clusterProfiler和ReactomePA进行基因集富集分析；xCell进行免疫和基质细胞组成估计；基于已发表人肝脏单细胞RNA测序图谱的肝脏谱系特征签名，采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）进行起源细胞分析，并衍生出双潜能指数（Bipotency Index）等复合指标。此外，在独立验证队列（445例肝胆肿瘤，含6例CBCA、88例iCCA、73例eCCA和278例HCC）上进行了GATA4免疫组织化学验证。

三、研究结果

患者队列组成。 10例CBCA发生于8例女性和2例男性患者，中位年龄32岁（范围23-54岁），肿瘤中位大小10.1 cm（范围6.2-25.4 cm），主要位于肝左叶（n=6）。全部10例CBCA的免疫组织化学显示抑制素A阳性，7例同时表达CK7、CK19、嗜铬粒蛋白A和突触素，且Hep-Par1阴性。融合转录本分析在334例肿瘤中检出20例（6%）存在致癌性融合基因：NIPBL::NACC1融合见于全部10例（100%）CBCA；FGFR2融合见于9例（6%）iCCA；ALK融合见于1例（3%）eCCA；其他诊断类别未检出其他融合基因。

全局转录组分析。 PERMANOVA显示诊断类别解释了总转录组变异的52.7%（F=51.95，df=7，p=0.001）。基于PCA的UMAP分析显示CBCA形成独立聚类，与所有其他诊断组分离，且位置最接近iCCA。全局转录组相关性分析显示CBCA与所有其他诊断的平均相关性最低（平均r=0.931），与iCCA的相关性最高（r=0.954）。轮廓分数在含6例及以上标本的诊断类别中，CBCA最高（平均=0.785），而iCCA、HCC、eCCA和GBCA均为负值。CBCA相对于所有其他诊断合计有1,451个基因显著差异表达（1,053个上调，398个下调），多于任何其他诊断类别。方向性重叠分析显示CBCA差异表达基因与其他诊断共享的比例为2.8%-15.8%，与iCCA重叠比例最低（2.8%），且呈方向不对称性。成对Jaccard相似性分析中，CBCA与所有比较对象的相似性均较低（J=0.027至0.109）。

差异基因表达与免疫组织化学验证。 CBCA中持续下调的基因包括免疫球蛋白重链和轻链转录本（如IGHA2、IGKC、IGHM等，相对于eCCA的log₂FC为-4.75至-5.19）以及急性期反应物和载脂蛋白转录本（相对于HCC，RMRP的log₂FC=-6.52）。INHA（编码抑制素A α亚基）在七组成对比较中的六组中为上调最显著的基因（log₂FC范围4.98-6.37），与CBCA弥漫性强抑制素A蛋白免疫标记的特征一致。突触蛋白基因SYN1、CPLX2和ECEL1在所有七组比较中均上调（log₂FC 4.61-5.87），SYP（编码突触素）亦显著上调（log₂FC=1.82）。转录因子GATA4在CBCA中相对于所有其他诊断上调（log₂FC=3.23），33个已确立的GATA4靶基因中有14个显著上调，其中INHA变化倍数最大（log₂FC=5.72）。GATA4免疫组织化学在445例独立验证队列中显示：6/6例CBCA（100%）呈强弥漫性核表达；161例胆管癌中仅3例（2%）iCCA呈弱局灶阳性；278例HCC全部阴性。FOXA2免疫组织化学在3例CBCA中均显示肿瘤细胞强核标记，而邻近正常肝细胞和胆管无着色。

通路富集分析。 基因集富集分析显示CBCA中富集程度最高的为突触和神经内分泌基因程序。Reactome神经元系统通路为所有测试基因集中标准化富集分数最高者（NES=2.36），由43个上调基因代表，包括SYN1、SYN2、CPLX1、GABBR2、GABRA5、KCNH5、KCNH6、GRIK3和GRIN2B。化学突触传递为第二富集的Reactome通路（NES=1.63）。基因本体（Gene Ontology）生物学过程分析中，神经递质转运、神经递质分泌、突触囊泡胞吐、突触囊泡周期和突触后膜电位调节等为CBCA中富集最显著的条目。130个检出的MYC靶基因中有50个在CBCA中上调；67个检出的神经内分泌分化基因中有23个（34%）差异表达（19个上调，4个下调），包括CHGB、SCG3和SYP；80个检出的TGF-β通路基因中有31个（39%）差异表达（12个上调，19个下调）。CBCA中耗竭的基因程序主要分为两类：适应性免疫和体液免疫程序（B细胞介导免疫、免疫球蛋白介导免疫应答、淋巴细胞介导免疫、补体激活等）以及细胞外基质和炎症程序。

免疫微环境分析。 xCell免疫细胞反卷积显示CBCA的总体微环境评分显著低于HCC、iCCA和eCCA，基质评分显著低于HCC。在髓系 compartment中，巨噬细胞评分（包括M1和M2极化群体）在全部10例CBCA中均为零，显著低于HCC、iCCA、eCCA和GBCA；活化髓系树突状细胞评分在CBCA中缺失，显著低于iCCA、eCCA、HCC、GBCA和HB；浆细胞样树突状细胞评分显著低于HCC。在淋巴细胞 compartment中，CD4+效应记忆T细胞评分显著低于iCCA、eCCA、GBCA和HCC，NK T细胞评分显著低于iCCA。总B细胞评分、总CD8+T细胞评分和调节性T细胞评分在CBCA与主要比较诊断之间无显著差异。

起源细胞分析。 细胞类型特征评分在全部8个诊断类别间均存在显著差异。CBCA的胆管上皮和胆管细胞评分均显著低于eCCA、iCCA和GBCA；胆管上皮评分与HCC无显著差异，而胆管细胞评分显著高于HCC和HB。CBCA的肝细胞特征评分显著低于HCC、HB和HA，显著高于GBCA和eCCA，与iCCA无显著差异。CBCA的肝祖细胞特征评分显著高于eCCA、GBCA和HCC，与iCCA和HB无显著差异。扩展分析中，包含GATA4、GATA6、TBX3、PROX1和FOXA转录因子家族的肝祖转录因子活性评分在CBCA中显著高于eCCA和GBCA，与iCCA和HCC无显著差异。胎儿肝母细胞评分在CBCA中显著高于GBCA、eCCA和iCCA，显著低于HB，与HCC无显著差异。胆管谱系转录因子活性评分（含HNF1B、SOX9、ELF3等）在CBCA与eCCA、iCCA、GBCA之间无显著差异。双潜能指数（Bipotency Index，即1减去min-max归一化肝细胞和胆管细胞特征评分的绝对差）在CBCA中（中位数=0.928）显著高于iCCA（0.803）、eCCA（0.528）、GBCA（0.583）和HCC（0.483），为所有诊断类别中最高。SALL4本身在CBCA中与其他诊断相比无显著差异，但多个SALL4相关的干/祖细胞基因差异表达。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究提供了CBCA的系统性WTS表征，三大主要发现为：NIPBL::NACC1融合基因在全部10例CBCA中检出而在其他324例肝胆肿瘤中均未检出，确认了其诊断特异性；CBCA具有广泛区别于所有传统胆管癌和肝细胞癌的转录程序，以突触和神经内分泌基因程序上调及以INHA为核心的GATA4驱动转录网络激活为特征；CBCA的细胞类型分化谱将其定位于中间胆管祖细胞状态，为其组织发生提供了转录组证据，并为CBCA分类和命名的持续争议提供了信息。研究人员回应了替代命名的反对意见：虽然CBCA的独立聚类和大量差异表达基因可被解读为支持独立分类，但融合基因定义的肿瘤在分子上区别于其传统对应物是普遍现象（如ALK重排肺腺癌和TFE3重排肾细胞癌均按其形态谱系分类而非独立实体）；保留的胆管谱系转录程序支持将CBCA归入胆管癌谱系；实性-管囊状结构并非CBCA所特有。研究人员还讨论了NIPBL::NACC1融合基因的分子结构（保留NIPBL外显子2-8编码序列及NACC1的BTB/POZ和BEN功能域）、NACC1通过MYC调控维持干细胞多能性的机制、ID2上调可能促进神经内分泌分化程序的机制，以及GATA4-INHA环路直接解释CBCA弥漫性抑制素A免疫反应性的机制。免疫排斥微环境及缺乏传统胆管癌驱动改变提示CBCA的治疗策略应靶向NIPBL::NACC1融合及其下游GATA4-INHA转录程序所定义的分子脆弱性，而非检查点抑制剂免疫治疗。

研究结论部分可翻译为：全转录组测序确立了CBCA是一种由NIPBL::NACC1融合基因定义的转录组学独特实体。转录组分化数据支持将其分类为胆母细胞型肿瘤，因为CBCA在蛋白水平表达胆管谱系标志物并维持胆管转录因子程序，但缺乏传统胆管癌的成熟胆管上皮基因表达，占据祖细胞阶段的中间分化位置。NIPBL::NACC1融合的主要转录后果是GATA4激活及其下游靶基因网络上调，其中INHA为主要效应基因。免疫排斥微环境和缺乏传统胆管癌驱动改变提示，CBCA的治疗策略应靶向NIPBL::NACC1融合及其下游GATA4-INHA转录程序所定义的分子脆弱性。