**可变剪接衍生中性粒细胞新抗原驱动系统性红斑狼疮T、B细胞免疫应答**

《Nature》：T and B cells recognize splicing-derived neutrophil neoantigens in lupus

　　

蛋白质组多样性通过可变mRNA剪接（alternative mRNA splicing）¹产生。在肿瘤中，含有内含子序列、外显子跳跃或导致移码的非经典供体/受体剪接位点的错误剪接转录本常被翻译为新抗原（neoantigen），驱动抗肿瘤免疫^2,3。本研究报告，与健康供者或类风湿关节炎患者的中性粒细胞不同，系统性红斑狼疮（SLE）患者的中性粒细胞含有许多异常剪接的基因转录本，其翻译被预测会产生正常剪接变体或任何其他蛋白质中均不存在的新氨基酸序列。通过质谱法在患者样本的I类主要组织相容性复合体（MHC）分子上检测到源自这些新氨基酸序列的21条肽段。将患者T细胞与源自新序列的重叠15聚体（15-mer）肽段共培养，导致CD4⁺和CD8⁺ T细胞扩增，这些细胞可被快速再激活并分泌干扰素-γ（IFN-γ）。T细胞抗原受体（TCR）测序及再表达将新抗原反应性转移至报告T细胞。SLE患者血清还含有识别新氨基酸序列内表位的IgG自身抗体。研究结果表明，SLE中性粒细胞中失调的mRNA剪接产生新抗原，引起T、B细胞活化、克隆扩增、IgG类别转换及自身免疫。

**研究背景与问题**　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种病因不明的致残性自身免疫病，累及多器官，以针对核蛋白、核酸相关蛋白及双链DNA的自身抗体为特征。抗原特异性T细胞应答在SLE中发挥重要作用，但T细胞所识别的抗原在很大程度上仍属未知。越来越多的证据提示固有免疫细胞参与SLE发病机制，包括多数患者I型干扰素水平升高。中性粒细胞日益被认为是SLE自身抗原（核酸及蛋白）的来源，这些抗原在NETosis、铁死亡等炎性细胞死亡过程中释放。SLE中性粒细胞呈现广泛基因组低甲基化，导致以I型干扰素为特征的转录谱。可变RNA剪接在转录过程中启动，产生成熟mRNA变体，深刻贡献于蛋白质组复杂性；剪接异常与自身免疫相关，逃逸无义介导的衰变（nonsense-mediated decay，NMD）已被证明可致自身免疫。中性粒细胞是胞内蛋白与核酸的丰富储库，具备作为自身抗原来源的潜力。研究人员据此推测SLE中性粒细胞中可能存在异常剪接并产生新抗原，从而开展系统研究。该论文发表于《Nature》。

**关键技术方法**　研究人员创建RiboSplitter流程将剪接变体翻译为蛋白产物；对34例SLE患者、20例健康供者及15例类风湿关节炎患者（均来自华盛顿大学风湿病学分库）外周血中性粒细胞行链特异性双端RNA测序（约5000万reads，101 bp）；以SplAdder识别剪接事件并结合arcasHLA分型；用NetMHCpan-4.1与NetMHCIIpan-4.0预测MHC亲和力；以逆转录PCR（RT–PCR）及Sanger测序验证剪接变体；用抗HLA免疫沉淀结合靶向液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）鉴定MHC结合肽；以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测新抗原特异性IgG；用14天扩增再刺激、ELISpot与流式细胞术检测T细胞应答，并行TCRβ测序与TIRTL-seq配对抗体测序，经逆转录病毒转导表达于T-FINDER报告细胞系；以识别聚合穿孔素孔的单克隆抗体行免疫荧光显微术。

**Cryptic splicing events in SLE neutrophils（SLE中性粒细胞中的隐蔽剪接事件）**　在34例患者中33例检出隐蔽剪接事件，共271个事件涉及130个基因，均不见于健康供者与类风湿关节炎患者；以异常外显子跳跃最多，其次为多外显子跳跃、非典型5′或3′剪接位点及内含子保留。通路分析显示显著偏向I型干扰素诱导基因（如IFI44L、MX1、OAS1、RSAD2、XAF1、IFI27、IFIT1），亦见于ABCG1、PSMF1、OGG1等非干扰素诱导基因。各患者事件数目与受累基因差异较大，剪接模式相对个体化；SLE单核细胞、干扰素处理健康供者中性粒细胞、干燥综合征中性粒细胞及两个SLE外周血单个核细胞（PBMC）数据集几乎未见相同事件，提示该模式为SLE中性粒细胞所特有。隐蔽剪接与干扰素诱导基因相关，但与抗核抗体、SLEDAI或激素使用无关。经翻译与MHC亲和力预测，各患者可获得数量不等的潜在新抗原肽，86条肽段位列前2%，其中65条位列前0.5%。

**Validation of cryptic splice variants（隐蔽剪接变体的验证）**　通过设计跨剪接事件的侧翼PCR引物并行RT–PCR与Sanger测序，在USP18（外显子6接11）、ABCG1（外显子8接10）、IFI44L（外显子3接6）、OAS1及MX1中验证了诊断性大小条带及连接序列，证实隐蔽变体丰度低于经典剪接变体，与RNA-seq读数一致。

**Detection of MHC-bound altered peptides（MHC结合改变肽的检测）**　用抗pan-HLA抗体免疫沉淀SLE中性粒细胞I类MHC分子，靶向LC–MS/MS在含预测新抗原肽的自建数据库中获得21条预测新肽的高置信谱图，称为bona fide新抗原；多数属最高亲和力组，唯MX1来源的10残基肽AGRRKEEEIL预测亲和力中等。

**Mechanisms of neoantigen generation（新抗原产生机制）**　USP18多外显子跳跃致外显子11移码并翻译24个密码子，产生新C端并鉴定出11氨基酸肽；MYO15B外显子41–43切除致外显子44移码，检出9残基肽；PHF11外显子11异常跳跃使翻译延续至非翻译的外显子12，产生HLA结合肽FQAGCHTQL；OAS1隐蔽事件致外显子7翻译26个密码子，产生FLLTGVDL肽；FCGRT中倒置AluJb元件96个核苷酸剪入产生32残基新序列及肽NLEWKETGF；MX1双外显子跳跃伴异常3′受体位点致外显子16移码。多数产肽事件位于开放阅读框3′端附近，不引入致NMD的提前终止密码子。

**Autoantibodies targeting translated neo-sequences（靶向翻译新序列的自身抗体）**　以覆盖新序列的15残基肽行ELISA，17/34例患者对IFI44L首个新肽呈IgG阳性，而经典IFI44L肽无反应增强；IgG亦识别OAS1、MX1、IFI44及RSAD2新序列肽。部分患者虽未检出相应剪接事件仍具抗体，提示事件可能发生于既往或受测序深度限制而漏检。

**Neoantigen-specific T cells（新抗原特异性T细胞）**　14天扩增再刺激后，10例患者中9例T细胞对多条新肽呈中至强反应，分泌IFN-γ与IL-17，CD4⁺与CD8⁺ T细胞CD69上调；经典IFI44L肽及随机序列对照肽无激活作用，健康供者T细胞反应微弱。TCRβ单细胞测序显示IFI44L肽刺激后特定TCR显著扩增，Simpson克隆性指数由0.006升至0.072与0.185。TIRTL-seq获得的TCR14在T-FINDER细胞中对IFI44L-2肽高度选择性反应，且10聚体池不能激活，提示该15聚体经II类MHC呈递、源于CD4⁺ T细胞。SLE中性粒细胞表面可见聚合穿孔素孔，而健康供者无，提示细胞毒性T细胞曾识别其表面抗原并尝试穿孔素杀伤，其比例低于类风湿关节炎。新抗原特异性T细胞频率估计可达每百万T细胞1–15个，与肿瘤抗原特异性T细胞相当；IgG自身抗体提示部分CD4⁺ T细胞提供了B细胞辅助，可能为滤泡辅助T细胞（TFH）或外周辅助T细胞（TPH）。

**讨论与结论**　研究人员提出，SLE中性粒细胞异常mRNA剪接产生的新抗原引入了本病发病机制的新模型：新抗原的出现而非耐受丧失是进行性免疫激活的驱动因素，免疫系统按程序全力清除“外来”新抗原，这或可解释疾病波动性病程、广泛器官表现及活动期所需强免疫抑制。该范式与SLE和SARS-CoV-2感染者中性粒细胞表达谱的相似性相符。与肿瘤中新抗原由异常剪接产生最大谱系的情形类似，SLE中异常剪接广泛存在，且50 million测序深度仅覆盖约60%剪接事件、数据为单时点，故实际剪接异常可能更广泛并随时间波动。I类MHC呈递使中性粒细胞易被细胞毒性CD8⁺ T细胞杀伤，穿孔素杀伤较凋亡更具炎症性。剪接核心因子及RNA结合蛋白表达改变、ENCODE中剪接因子敲低可重现部分隐蔽事件（DDX24、SF3B4为交集候选），Ro60亦为候选；PTBP1与ELAVL1低表达或可解释倒置Alu、HAL1等隐蔽外显子化。新抗原在SLE发病中的重要性最终需通过阻断其产生的药物临床试验确定；抗CD19嵌合抗原受体T细胞实现B细胞完全清除而获 apparent cure 的工作，支持B细胞在新抗原呈递与后续免疫中的核心作用。研究结论为：SLE中性粒细胞中失调的mRNA剪接产生新抗原，已引起T、B细胞活化、克隆扩增、IgG类别转换及自身免疫。