针对转录因子SPI1通过TIM-3/NF-κB轴减轻帕金森病神经炎症与多巴胺能神经元变性的研究

《Neurotherapeutics》：Targeting the transcription factor SPI1 attenuates neuroinflammation and dopaminergic degeneration in Parkinson’s disease via the tim-3/NF-κb axis

　　

小胶质细胞介导的神经炎症是帕金森病（PD）中多巴胺能神经元丢失的关键驱动因素，是疾病修饰治疗的可行靶点。尽管转录因子Spi-1原癌基因（SPI1）被认为参与小胶质细胞调控，但其在PD中的具体病理作用与治疗潜力仍不明确。本研究利用体内1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠模型和体外1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP⁺）刺激的小胶质细胞，确定SPI1是PD相关神经炎症的关键调控因子。研究发现，SPI1在两种PD模型中均异常上调。关键的是，敲低SPI1可显著改善运动缺陷、减轻多巴胺能神经元丢失，并通过减少促炎细胞因子抑制神经炎症。机制上，研究揭示SPI1直接结合T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）的启动子以激活其转录。沉默SPI1可通过下调TIM-3并随后抑制核因子κB（NF-κB）信号通路，促进小胶质细胞由促炎M1表型向神经保护性M2表型转变，从而保护突触功能免受损伤并减少神经元凋亡。总之，研究结果阐明了小胶质细胞极化中新的SPI1/TIM-3/NF-κB调控轴，并强调靶向抑制SPI1是改善神经炎症、阻止帕金森病疾病进展的有前景的治疗策略。

帕金森病（PD）是患病率最高的神经退行性疾病之一，全球受累人数超过1100万，临床以运动症状（运动迟缓、肌强直、震颤）和非运动症状（抑郁、便秘、睡眠障碍、认知障碍）为特征，病理标志为纤维状α-突触核蛋白（α-Syn）聚集体（路易小体）形成及黑质致密部（SNpc）多巴胺能（DA）神经元变性。尽管发病机制研究取得进展，其内在机制仍未完全阐明，制约了防治策略的开发。越来越多证据表明神经炎症在PD发病与进展中起关键作用：α-Syn聚集成寡聚体或纤维，触发以小胶质细胞为主 orchestrated 的神经炎症级联反应；小胶质细胞占脑内细胞总数的5–15%，是中枢神经系统（CNS）主要的固有免疫细胞，在维持CNS稳态中发挥基础作用，但其异常激活并产生IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎介质，是PD慢性神经炎症相关CNS退变的主要驱动因素。小胶质细胞可活化为促炎（M1）或抗炎（M2）两种表型，α-Syn触发M1极化导致促炎细胞因子过度释放，引发广泛DA神经元变性，M1/M2表型间的动态平衡与PD进展密切相关。

Spi-1原癌基因（SPI1），又称PU.1，属E26转化特异性（ETS）家族转录因子，是CNS中小胶质细胞稳态的主调控因子。已有报道SPI1通过调控神经炎症和小胶质细胞吞噬加重神经病理性疼痛；脑出血后小胶质细胞中SPI1表达升高，与吞噬、糖酵解和自噬相关；在阿尔茨海默病（AD）中，敲低SPI1可促进M2极化、抑制神经炎症从而缓解疾病进展。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）表达于Th1、Th17细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等多种免疫细胞，是固有免疫和适应性免疫的关键检查点调控因子；TIM-3缺失可改变小胶质细胞表型、减少β-淀粉样蛋白（Aβ）负荷并改善AD小鼠认知；研究人员前期研究已证实TIM-3在PD小胶质细胞中表达上调，并通过核因子κB/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NF-κB/NLRP3）轴发挥促炎作用，而NF-κB亦是小胶质细胞极化的关键调控因子。然而，SPI1与TIM-3之间的相互作用及SPI1调控PD神经炎症和小胶质细胞功能的精确机制尚待阐明。本研究旨在利用PD模型探究SPI1与TIM-3在神经炎症中的调控关系并阐明其分子机制，证明SPI1通过直接结合TIM-3启动子转录激活TIM-3，且敲低SPI1主要通过TIM-3/NF-κB信号轴调控小胶质细胞极化，从而减轻PD模型中的突触损伤和DA神经元变性，揭示SPI1作为PD中小胶质细胞介导神经炎症关键调控因子的新机制及其作为临床干预治疗靶点的潜力。

研究方法方面，研究人员以小鼠小胶质细胞系BV2和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系（购自中国科学院细胞库）为体外研究对象，用250 μM MPP⁺处理BV2细胞24 h建立体外PD模型，并以BV2条件培养基（CM）按1:2与新鲜神经元培养基混合后处理SH-SY5Y细胞12 h以研究小胶质细胞介导的神经炎症对神经元的影响；采用靶向Spi1的短发夹RNA（shRNA）和TIM-3过表达质粒转染BV2细胞。动物实验采用6–8周龄雄性C57BL/6小鼠（购自北京SPF生物技术有限公司），经立体定位注射腺相关病毒9（AAV9）至双侧SNpc（坐标：AP=?3.0 mm，ML=±1.5 mm，DV=?4.0 mm），14天后以30 mg/kg腹腔注射MPTP连续7天建立PD模型。关键技术方法包括：转棒实验、爬杆实验和旷场实验等行为学分析；免疫荧光（IF）染色与激光共聚焦成像；高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测纹状体儿茶酚胺（CA）、多巴胺（DA）及高香草酸（HVA）水平；透射电子显微镜（TEM）观察突触超微结构；定量实时PCR（qRT-PCR）与Western blotting检测基因和蛋白表达；染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验验证转录调控；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色评估细胞活力与凋亡；数据以GraphPad Prism 9.5行单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。

研究结果如下。“SPI1上调与MPTP诱导PD小鼠模型中的运动功能障碍和DA神经元变性相关”：行为学测试显示MPTP组小鼠转棒跌落潜伏期缩短、爬杆下降时间延长、旷场总移动距离减少；qRT-PCR和Western blotting证实MPTP组SN中Spi1 mRNA及SPI1蛋白显著升高，MPP⁺处理的BV2细胞中亦如此；免疫荧光显示SN中SPI1过表达，伴广泛小胶质细胞激活和TH阳性DA神经元明显丢失，并可见显著星形胶质细胞增生，提示SPI1异常上调与小胶质细胞激活及DA神经元变性密切相关。

“敲低SPI1减轻MPTP处理小鼠的运动缺陷和神经变性”：于MPTP给药前2周向SNpc立体定位注射AAV-sh-SPI1（其中sh-SPI1-1敲低效率最高）；行为学显示SPI1敲低恢复转棒跌落潜伏期、缩短爬杆下降时间并显著恢复旷场总移动距离；qRT-PCR和Western blotting证实AAV-sh-SPI1有效逆转MPTP诱导的SPI1升高；MPTP所致突触标志物Synapsin I和PSD-95的mRNA及蛋白水平下降被SPI1敲低有效逆转；TEM显示对照组突触结构完整、前后膜清晰、突触间隙清楚，MPTP组突触结构模糊、膜与间隙难以分辨，而MPTP+AAV-shSPI1组部分恢复；免疫荧光显示MPTP组SNpc中TH信号大幅丢失，SPI1敲低显著逆转；HPLC-MS/MS显示MPTP诱导的CA、DA及HVA严重耗竭被AAV-sh-SPI1显著阻止。上述结果证实敲低SPI1可改善运动缺陷、保持突触结构完整性并对MPTP诱导的多巴胺能毒性发挥神经保护作用。

“SPI1敲低调控MPP⁺诱导体外模型中的小胶质细胞极化”：三种靶向SPI1的shRNA在体外均显示显著敲低效率；MPP⁺处理显著升高M1标志物IL-1β和iNOS的mRNA水平并降低M2标志物Arg1和CD206，SPI1敲低有效逆转上述变化；共聚焦免疫荧光显示MPP⁺+shSPI1组中与Iba1共定位的iNOS强度较MPP⁺组显著降低，而Iba1阳性细胞中Arg1表达显著恢复，表明SPI1敲低通过促进小胶质细胞由促炎M1向神经保护性M2表型转变而发挥抗炎作用。

“SPI1敲低通过靶向TIM-3/NF-κB信号轴减轻体外PD模型中的神经炎症反应”：qRT-PCR显示MPP⁺处理的BV2细胞中TIM-3、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA显著升高，SPI1敲低有效逆转；Western blotting显示SPI1敲低消除MPP⁺诱导的TIM-3蛋白上调；MPP⁺处理后M2相关抗炎标志物（IL-10、Arg1、Ym1）明显降低，SPI1敲低显著恢复该趋势；M1相关促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平被SPI1敲低有效减弱；MPP⁺组p65（p-p65）和IκBα（p-IκBα）磷酸化显著增加，SPI1敲低有效逆转该激活；SPI1敲低还减弱MPP⁺诱导的NLRP3炎症小体通路激活（NLRP3、ASC、Caspase-1水平降低）。结果提示SPI1敲低通过TIM-3和NF-κB通路调控小胶质细胞M2极化而发挥神经保护作用。

“SPI1沉默促进MPTP诱导PD小鼠模型中小胶质细胞M1向M2表型转变并减轻神经炎症”：Western blotting显示MPTP处理显著上调TIM-3表达，SPI1敲低有效逆转；MPTP使小胶质细胞向促炎表型转变，M1标志物（IL-1β、IL-6、TNF-α）显著上调而M2标志物（IL-10、Arg1、Ym1）下调，SPI1敲低有效挽救这些变化；SPI1敲低抑制MPTP诱导的NF-κB通路激活，减弱p-p65和p-IκBα上调并逆转p65核转位（胞质p65恢复、核内p65蓄积减少）；Iba1与p65双免疫荧光显示MPTP诱导p65显著上调并与Iba1阳性小胶质细胞共定位，定量分析证实MPTP引起显著小胶质细胞增生（Iba1强度增加）和p65蓄积，而AAV介导的SPI1敲低在Iba1⁺细胞中显著减弱二者。结果从形态学和分子层面表明SPI1敲低通过TIM-3和NF-κB通路改善MPTP诱导的小胶质细胞激活并促进M1向M2转变。

“SPI1转录调控TIM-3以调节PD模型中的小胶质细胞极化和神经炎症”：JASPAR数据库预测TIM-3启动子内存在3个SPI1结合位点（SBSs）；ChIP结果显示SPI1可与TIM-3启动子位点1结合；双荧光素酶报告基因实验结合定点突变显示SBS1突变显著消除SPI1介导的TIM-3转录上调。进一步通过共转染sh-SPI1与TIM-3过表达载体行挽救实验：qRT-PCR显示SPI1敲低显著降低M1标志物（IL-1β、iNOS）mRNA并升高M2标志物（Arg1、CD206），而TIM-3过表达逆转上述效应；Western blotting显示SPI1敲低上调M2抗炎标志物（IL-10、Arg1、Ym1），TIM-3过表达部分消除该作用，并逆转sh-SPI1对M1促炎标志物（IL-1β、IL-6、TNF-α）的抑制作用；sh-SPI1组p-IκBα和p-p65磷酸化水平显著降低提示NF-κB通路受抑，而TIM-3过表达使该通路重新激活；NLRP3及相关指标结果一致。结果表明SPI1通过转录激活直接调控TIM-3表达，其在PD中调控小胶质细胞极化和神经炎症的作用依赖TIM-3。

“SPI1敲低以TIM-3依赖方式改善突触损伤和DA神经元变性”：收集经上述处理（Control、MPP⁺、MPP⁺+sh-SPI1、MPP⁺+sh-SPI1+TIM-3）的小胶质细胞条件培养基孵育SH-SY5Y细胞；CCK-8和TUNEL实验显示MPP⁺处理小胶质细胞CM显著降低SH-SY5Y细胞活力并增加凋亡，MPP⁺+sh-SPI1组CM部分减轻神经元损伤（活力改善、凋亡减少），而小胶质细胞TIM-3过表达消除上述保护作用；qRT-PCR和Western blotting显示MPP⁺ CM使SH-SY5Y细胞Synapsin I和PSD-95 mRNA及蛋白水平降低，SPI1敲低部分挽救，TIM-3过表达则抵消该挽救效应；免疫荧光显示MPP⁺组Synapsin I、PSD-95和DA标志物TH荧光强度降低，SPI1敲低部分恢复，TIM-3过表达逆转该保护。结果提示SPI1敲低通过以TIM-3依赖方式促进M2极化、抑制神经炎症，从而挽救突触缺陷并防止DA神经变性。

讨论部分指出，本研究报道SPI1在PD模型中显著上调，且与TIM-3水平升高及小胶质细胞介导的炎症密切相关；敲低SPI1促进小胶质细胞由M1向M2转变，其神经保护效应（突触完整性保持和DA神经元丢失减少）由TIM-3下调及随后NF-κB通路抑制介导。SPI1广泛表达于外周髓系细胞并调控多种免疫细胞功能，近期研究突出其在小胶质细胞发育和成熟中的作用，如在脑出血中经PI3K/AKT/mTOR通路调控炎症反应；AD遗传关联研究提示与SPI1高表达相关的变异与更早发病相关，而降低SPI1表达可通过限制神经炎症降低AD风险、延迟发病，但亦有相反报道。就PD而言，生物信息学和转录组分析提示SPI1可能是致病关键分子，但确切机制不明。本研究发现体内外PD模型中SPI1表达均升高，并进一步阐明其调控神经炎症的具体机制：抑制SPI1可抑制炎症反应、保持突触完整性、防止DA神经元丢失，最终改善PD小鼠运动缺陷，提示SPI1是PD发病的关键介导者和有前景的治疗靶点；SPI1升高与小胶质细胞激活的相关性与既往报道一致。小胶质细胞激活后可分为促炎M1和抗炎M2表型，聚集的α-Syn作为危险相关分子模式（DAMP）直接激活小胶质细胞，M1极化失衡是PD神经炎症进展的关键驱动因素；本研究中PD模型小胶质细胞明显向M1转变，伴IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子升高；既往研究已确立SPI1调控小胶质细胞发育和激活，敲低SPI1可促进M2极化、抑制神经炎症从而缓解AD和年龄相关性黄斑变性模型病理；本研究一致地显示抑制SPI1促进M1向M2转变并抑制经典NF-κB炎症通路，从而保持突触完整性和DA神经元。基于前期发现TIM-3是PD神经炎症关键介质，本研究进一步阐明其与SPI1的调控关系：TIM-3是已确立的免疫检查点，在脑出血和AD中通过促进M1极化和氧化应激加重炎症，在PD中Galectin-9/TIM-3轴介导DA神经变性；本研究确立SPI1为TIM-3的直接转录调控因子，荧光素酶报告实验证实SPI1特异性结合TIM-3启动子区域，SPI1敲低显著降低TIM-3表达、驱动M1向M2转变并恢复细胞因子稳态；TIM-3过表达可消除SPI1敲低的抗炎和神经保护效应，证实SPI1在PD中的病理作用很大程度上依赖TIM-3；SPI1/TIM-3轴触发NF-κB激活并导致IL-1β、IL-6、TNF-α释放，与既往SPI1调控NF-κB的报道一致。研究亦指出若干局限：不能排除其他转录因子或共调控因子的贡献；依赖瞬时siRNA敲低可能无法完全模拟基因完全敲除，未来需小胶质细胞特异性Spi1条件性敲除小鼠提供更明确的体内验证；机制研究主要使用BV2细胞系，其不能完全模拟成体脑来源小胶质细胞的表观遗传和转录组特征，尚需原代小胶质细胞培养验证；DA神经元完整性采用2D计数而非无偏体视学分析；研究主要依赖体外条件培养基模型，收集CM前缺乏MPP⁺洗脱步骤，且该模型不能完全重现脑微环境的系统复杂性，需更严格的体内研究和实验方案进一步证实SPI1敲低在完整CNS中的神经保护效力。

研究结论翻译如下：总之，本研究提供了有力证据，表明在PD模型的活化小胶质细胞中SPI1是TIM-3的直接转录调控因子。这些发现表明SPI1协调小胶质细胞极化并在PD发病过程中驱动神经炎症激活。因此，靶向异常的SPI1信号为恢复神经免疫稳态提供了新策略，凸显其作为PD治疗靶点的潜力。