高亲和力Sigma-1/2受体化合物B1F的抗精神病样作用研究

《Neurotherapeutics》：Antipsychotic effect of the high-affinity sigma-1/2 receptor compound B1F

　　

目前抗精神病药物对精神分裂症（schizophrenia）的阴性症状和认知症状疗效有限，亟需新型治疗策略。研究人员评估了新发现的高亲和力Sigma-1/2受体（Sigma-1/2 R）化合物B1F。研究发现，B1F可减轻MK-801诱导的高活动性（hyperlocomotion）并逆转前脉冲抑制（prepulse inhibition, PPI）缺陷。B1F还可改善慢性MK-801诱导的社会交往（social interaction）和认知功能损伤。药理学阻断及基因敲除Sigma-1R可减弱但未能完全消除B1F对精神分裂症样行为的作用，提示除Sigma-1R外，其他组分（可能为Sigma-2R）亦参与该药物作用。重要的是，与经典抗精神病药物不同，B1F在治疗剂量下不引起锥体外系症状（extrapyramidal symptoms, EPS）。最后，研究发现B1F处理可抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）并激活cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CREB），从而促进脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）生成，同时减轻内质网应激（endoplasmic reticulum stress）。这些发现提供了概念验证性证据，表明B1F的抗精神病样作用在很大程度上依赖Sigma-1R，同时存在性质尚待明确的Sigma-1R非依赖性组分。B1F可有效改善精神分裂症样损伤且不诱导EPS，可能成为抗精神分裂症的有前景候选药物。

**研究背景与问题**：精神分裂症是一种严重慢性精神疾病，以阳性症状、阴性症状、认知损害及高致残率、高复发率为特征。其病理生理机制尚未完全阐明，但神经递质传递失调和突触可塑性受损被认为是主要因素。现有抗精神病药物主要通过拮抗多巴胺D2受体发挥作用，对阳性症状较有效，而对阴性症状和认知缺陷治疗不足；长期用药还受锥体外系不良反应和代谢不良反应限制。因此，亟需靶向非多巴胺能机制的治疗策略。越来越多临床和临床前证据支持Sigma受体作为精神分裂症潜在治疗靶点：Sigma-1R是富集于线粒体相关内质网膜的细胞内伴侣蛋白，调控Ca²⁺信号、内质网（ER）应激、线粒体功能和细胞存活，并调节谷氨酸能、多巴胺能和5-羟色胺能神经传递，参与突触可塑性和认知；选择性Sigma-1R激动剂和变构调节剂已显示抗精神病样作用，尤其对阴性症状和认知缺陷。Sigma-2R（已鉴定为TMEM97）研究较少，参与细胞增殖、自噬、脂质代谢和细胞稳态，其靶向化合物也已进入中枢神经系统疾病临床试验。鉴于二者功能各异但可能互补，同时调节两受体或较单独选择性调节Sigma-1R提供更广泛治疗获益。基于此，研究人员研究了新开发的、对两受体均具纳摩尔亲和力的Sigma-1/2 R调节剂B1F，表征其功能活性，并在MK-801诱导的小鼠精神分裂症样行为模型中评价其对高活动性、感觉运动门控、社会行为和认知功能的作用，旨在提供Sigma-1/2 R调节作为新型非多巴胺能治疗策略的概念验证证据。

**主要技术方法**：研究人员采用放射性配体结合实验（大鼠全脑匀浆，[³H]-(+)-pentazocine标记Sigma-1R、[³H]-1,3-Di(2-tolyl)-guanidine标记Sigma-2R）测定B1F亲和力；用44种经典靶点（含GPCR、核受体、离子通道、酶和转运体）激动/拮抗功能实验评价选择性；细胞水平采用共免疫沉淀（Co-IP）、Western blotting、MTT细胞活力实验；动物实验使用雄性C57BL/6小鼠（购自上海吉辉实验动物饲养有限公司）及Sigma-1R基因敲除（Sigma-1 KO）小鼠，结合药理学阻断剂BD1063，开展自主活动、前脉冲抑制（PPI）、社会交往（SI）、新物体识别（NOR）、Y迷宫及僵住症（bar test）等行为学检测，并以Western blotting分析内侧前额叶皮质信号蛋白。

**研究结果**：

*B1F对Sigma-1/2R的功能作用*：在HT-22、BV2、MES23.5和HEK293T细胞中，B1F浓度低于80 μM无明显细胞毒性，故细胞实验采用≤20 μM。在共表达Sigma-1R与BiP的HEK293T细胞中，B1F（10 μM）促进Sigma-1R与BiP的时间依赖性解离；在HT-22细胞中B1F以浓度和时间依赖方式增加GSK3β-Ser9磷酸化，10 μM作用1 h达最大效应，该效应亦见于选择性Sigma-1R激动剂SKF10047，并被Sigma-1R拮抗剂BD1063消除，支持B1F对Sigma-1R具有功能激动活性。在主要表达Sigma-2R的MCF-7细胞中，B1F浓度依赖性降低细胞活力，20 μM处理24 h使活力降至约60%，与推定Sigma-2R激动剂siramesine相当，且被Sigma-2R拮抗剂rimcazole完全阻断；在BD1063阻断Sigma-1R的SH-SY5Y细胞中，B1F增加NPC1表达、降低HMGCR和ACC1水平，提示B1F可能具有Sigma-2R相关功能活性，但仍需进一步确认。此外，1 μM B1F对44种经典靶点（尤其多巴胺D1、D2受体，5-HT_1A、5-HT_1B、5-HT_2A、5-HT_2B受体，组胺H1、H2受体，毒蕈碱M1–M3受体，α_1A–α_2A及β₁–β₂肾上腺素能受体，DAT/SERT/NET转运体，GABA_A受体和hERG通道）仅表现无至微弱抑制（约30.90%）或激活（约14.58%）。

*B1F以部分依赖Sigma-1R的方式改善MK-801诱导的高活动性和PPI缺陷*：预实验显示B1F 10 mg/kg轻度抑制自发活动，故选用0.5、1、5 mg/kg进行疗效研究。B1F 1和5 mg/kg显著减轻MK-801诱导的高活动性，BD1063预处理部分逆转该效应；B1F改善MK-801诱导的PPI缺陷，5 mg/kg在三个前脉冲强度下均使PPI恢复至与利培酮相似水平，BD1063显著减弱B1F在76和83 dB（而非87 dB）的PPI改善。与药理学结果一致，B1F的行为效应在Sigma-1R敲除小鼠中减弱：B1F显著抑制野生型而非Sigma-1R敲除小鼠的MK-801诱导高活动性（P = 0.1654）；B1F对76和83 dB PPI的作用在敲除小鼠中亦减弱。上述结果提示B1F对MK-801诱导高活动性和感觉运动门控缺陷的作用部分依赖Sigma-1R，残余效应提示存在其他Sigma-1R非依赖机制。

*B1F以部分依赖Sigma-1R的方式缓解MK-801诱导的社会和认知损伤*：在慢性MK-801诱导社会与认知缺陷小鼠中，B1F 1和5 mg/kg显著增加社会交往时间并改善新物体识别和空间辨别测试表现；BD1063预处理显著减弱但未消除这些行为改善，提示Sigma-1R贡献显著。与之一致，B1F在相应剂量下对社会交往和认知缺陷的改善优于选择性Sigma-1R激动剂15 d。结果提示B1F对MK-801诱导社会和认知损伤的获益作用主要由Sigma-1R依赖机制介导，同时可能有Sigma-1R非依赖机制（潜在涉及Sigma-2R）参与，但尚待明确。

*B1F在测试剂量下不诱导锥体外系症状*：采用僵住症实验评价EPS。B1F在1至10 mg/kg剂量下未引起明显僵住或肌强直，而阳性对照利培酮（3 mg/kg）在30 min内引起明显僵住行为，提示B1F作为经非多巴胺能机制发挥作用的新型抗精神病候选药物具有潜在优势。

*B1F促进AKT-GSK3β-CREB-BDNF信号通路激活并缓解内质网应激*：在慢性MK-801处理小鼠内侧前额叶皮质中，MK-801显著降低BDNF表达，而B1F治疗一周恢复BDNF水平；慢性MK-801降低p-AKT（Ser473）、p-GSK3β（Ser9）和p-CREB（Ser133），均被B1F显著恢复；B1F还抑制MK-801诱导的ER应激标志物p-PERK、p-IRE1和ATF6升高。结果提示B1F恢复AKT–GSK3β–CREB–BDNF信号并缓解内侧前额叶皮质ER应激。

**讨论与结论**：本研究将B1F表征为对Sigma-1/2 R均具功能活性的高亲和力化合物，并在MK-801诱导小鼠模型中显示广泛抗精神病样药理作用，改善高活动性、PPI缺陷、社会退缩和认知损伤。BD1063药理学阻断及Sigma-1R基因敲除显著减弱但未消除这些行为效应，支持Sigma-1R的重要贡献；值得注意的是，在Sigma-1R结合亲和力与选择性、关键药代动力学参数（T_max和F值）相当且15 d脑暴露更高的情况下，B1F在相同剂量下改善社会功能障碍的疗效优于选择性Sigma-1R激动剂15 d。Sigma-1R已知调节多巴胺能和谷氨酸能神经传递并与精神分裂症相关，Sigma-2R/TMEM97则调控胆固醇稳态、脂质代谢和细胞应激反应。结合Sigma-1R阻断或敲除后的残余疗效以及B1F在减轻Sigma-1R介导的内质网应激方面略强于15 d，这些发现表明B1F的抗精神病样作用主要由Sigma-1R介导，但显然存在性质尚待明确的Sigma-1R非依赖组分；尽管部分数据提示Sigma-2R可能参与，其体内直接确证仍需选择性药理学或遗传学干预。分子层面上，B1F恢复MK-801诱导精神分裂症样行为小鼠内侧前额叶皮质的AKT–GSK3β–CREB–BDNF信号并减轻ER应激；BDNF对神经元存活、突触可塑性和认知至关重要，在精神分裂症及相关实验模型中报道降低，AKT–GSK3β–CREB通路失调亦见于精神分裂症并可能构成BDNF表达下降的基础，与这些观察一致，慢性MK-801降低p-AKT、p-GSK3β、p-CREB和BDNF表达而被B1F显著逆转，同时B1F降低MK-801诱导的p-PERK、p-IRE1和ATF6升高。鉴于Sigma-1/2 R在神经可塑性和ER应激调控中的既定作用，恢复AKT–GSK3β–CREB–BDNF信号和减轻ER应激可能 contribute 于B1F的行为获益。B1F另一显著优势是在药理有效剂量下不引起僵住症，提示相较传统基于D2受体的抗精神病药物具有潜在优势；这并不意外，因为已有广泛报道Sigma-1/2 R激动调节剂治疗可有效缓解帕金森病动物模型的显著运动迟缓、运动障碍、握力受损和运动不协调，尽管确切机制尚待阐明，越来越多的证据清楚表明靶向Sigma-1/2 R可有效减轻实验动物EPS的发生。研究结论为：B1F的抗精神病样效应在很大程度上依赖Sigma-1R，并存在性质尚待明确的Sigma-1R非依赖组分；B1F可有效对抗精神分裂症样损伤且不诱导EPS，可能是抗精神分裂症的有前景候选药物。