食品级路易波士磷脂复合物的构建表征及其在IPEC-J2细胞中的抗炎与屏障保护作用

《NFS Journal》：Development and characterisation of a food-grade rooibos-phytosome and its anti-inflammatory and barrier-protective effects in IPEC-J2 cells

　　

本研究旨在利用未发酵路易波士乙醇提取物（unfermented rooibos ethanolic extract，RbEE）开发并表征一种路易波士磷脂复合物（rooibos-phytosome），并评价其在肠道猪上皮细胞（Intestinal Porcine Epithelial Cells，IPEC-J2）中的抗炎与屏障保护作用。路易波士（*Aspalathus linearis*）含有独特的生物活性黄酮类化合物，但其治疗潜力常受水溶性差和生物利用度低的限制。为解决这一问题，研究比较了两种磷脂——Lipoid 45（Lip45）与GR-Soy卵磷脂——形成磷脂复合物的能力。理化表征确定Lip45-Rb-磷脂复合物更优，其平均粒径小（71.79 nm）、稳定性高（zeta电位?43.8 mV）、包封率为74.07%。通过X射线粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）证实了通过氢键实现的成功复合。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的IPEC-J2细胞中进行生物学评价显示，Lip45-Rb-磷脂复合物（0.125 mg/mL）预处理可显著减弱炎症反应，表现为白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）蛋白产生大幅减少，以及促炎基因IL-8、IL-6和Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）表达的显著下调。此外，该磷脂复合物显著上调紧密连接基因claudin-4的表达，表明其对肠屏障完整性具有保护作用。这些结果表明，磷脂复合物包封可有效增强未发酵路易波士的健康促进特性和生物学功效。该递送系统为优化路易波士基功能性食品用于胃肠道健康的治疗潜力提供了稳健平台。

**研究背景与立项依据**

功能性食品是指除基本营养价值外还具备健康益处的膳食成分，包括抗炎活性和肠道健康保护作用。世界卫生组织（WHO）数据显示，发展中国家约80%的人群仍依赖草药治疗疾病，近年来将草药产品纳入功能性食品在发达国家日益受到关注。然而，提取物类生物活性成分和功能性配料常因生物利用度低、渗透性差和溶解性差而疗效受限，可通过食品级药物递送系统加以改善：将生物活性化合物包裹于脂质层中可提高其溶解性、生物利用度和稳定性，并实现作用部位的控释。磷脂复合物（phytosome）是众所周知的基于磷脂的生物相容性载体，由磷脂与植物化合物（如酚类化合物）之间的氢键自组装形成，可改善稳定性并提高生物利用度。路易波士（*Aspalathus linearis*）是南非草本茶，以抗炎和上皮屏障保护特性著称，其活性与其独特黄酮类成分相关，包括黄酮（orientin、isoorientin、vitexin、isovitexin、luteolin、chrysoeriol）、黄烷酮（dihydro-orientin、dihydro-isoorientin、hemiphlorin）和黄酮醇（quercetin、hyperoside、isoquercitrin、rutin、bioquercetin），并含有路易波士特有的稀有双氢查尔酮C-葡萄糖苷aspalathin和nothofagin以及环状双氢查尔酮aspalalinin。此前研究表明，未发酵和发酵路易波士水提物均可调节LPS刺激的IPEC-J2细胞炎症反应，未发酵路易波士可增强紧密连接相关基因表达。但Caco-2单层研究显示aspalathin虽可穿过肠上皮屏障，其表观渗透性较低；人体研究亦检测到完整aspalathin及其代谢物，但血浆和尿液中含量提示全身生物利用度相对有限。因此，本研究旨在开发并表征未发酵路易波士乙醇提取物的磷脂复合物制剂，并初步评价其在LPS刺激IPEC-J2细胞中的抗炎和上皮屏障保护作用。该研究为概念验证性研究，旨在确定路易波士生物活性成分的磷脂复合物递送能否调节肠道炎症反应和部分屏障相关标志物；更全面的肠屏障完整性、紧密连接蛋白及分子机制研究将在本概念验证建立后开展。

**主要关键技术方法**

研究以商业来源未发酵路易波士茶叶（Carmien Tea，Citrusdal，南非）制备RbEE，经乙醇提取和Amberlite XAD-4柱层析纯化，用反相薄层色谱（RP-TLC）确认aspalathin和nothofagin。分别以Lipoid 45和GR-Soy卵磷脂为磷脂载体，采用溶剂蒸发法和改良法制备两种磷脂复合物，并以同样方法制备空白磷脂复合物。采用Zetasizer测定粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位；高效液相色谱（HPLC）定量酚类成分；以氯仿溶解法结合HPLC计算包封率（EE）和载药量（LC）；采用STEM和SEM观察形貌；采用XRPD、FTIR、DSC和NMR进行理化分析。生物学评价使用BIOMIN（维也纳，奥地利）提供的IPEC-J2细胞，以水溶性地塞米松为阳性抗炎对照，经细胞活力（CellTiter-Glo检测ATP）、Caspase-Glo 3/7凋亡检测、实时定量PCR（以porcine GAPDH为内参，2^???CT法）和猪ELISA检测IL-8蛋白。

**研究结果**

*Lip45-与GR-Soy-路易波士磷脂复合物的评价*：通过粒径、PDI、zeta电位、EE和LC比较两种磷脂复合物。粒径、分散性与zeta电位方面，Lip45形成更小的囊泡（平均71.79 nm），GR-Soy为88.93 nm；两者PDI均低于0.3，Lip45略高（0.28）于GR-Soy（0.25）；两者zeta电位均低于?30 mV，提示良好的排斥和抗聚集稳定性，Lip45-Rb-磷脂复合物（?43.80 mV）略较GR-Soy-Rb-磷脂复合物（?33.97 mV）稳定。酚类组成、包封率与载药量方面，Lip45-Rb-磷脂复合物包封RbEE化合物达74.04%、LC为18.17%，GR-Soy-Rb-磷脂复合物EE为30.56%、LC为9.79%，前者EE和LC约为后者两倍。RbEE中以aspalathin含量最高（50.94 g/100 g），其次为orientin、isoorientin和nothofagin；Lip45-Rb-磷脂复合物对各化合物的EE（68.84%～82.00%）均高于GR-Soy-Rb-磷脂复合物（25.26%～43.18%）。理化分析方面，XRPD显示所有样品完全无定形，表现为2θ=14～25°的宽晕峰；Lipoid 45形成磷脂复合物后无定形晕增大，而GR-Soy则减小。FTIR显示磷脂复合物谱图与磷脂空白相关、仅有微小变化，包括3100～3600 cm^?1处OH带轻微增宽、约1200 cm^?1处PO伸缩带变形及1740 cm^?1处羧酸峰降低。DSC热分析图印证了XRPD所示的无定形性质：RbEE在30～100 °C出现宽吸热事件，提示颗粒表面水分；Lipoid 45和GR-Soy分别在约190 °C和200 °C出现相变起始，与此前报道一致。NMR谱显示磷脂复合物谱中几乎观察不到RbEE的特征峰，提示大部分路易波士化合物已结合；酚类化合物和羰基通常在4～7 ppm和9～11 ppm区域出峰，而在磷脂复合物谱中这些峰缺失或显著减弱，提示酚类化合物与磷脂之间形成氢键；Lip45-Rb-磷脂复合物在约3.25 ppm处信号被抑制，GR-Soy-Rb-磷脂复合物在3.0～3.5 ppm之间两个峰被抑制，该区域信号通常归属于磷脂的N–(CH₃)₃基团；4～6 ppm区域与CH₂–P–O基团相关的峰未改变；GR-Soy-Rb-磷脂复合物中约1.25 ppm处脂肪酸链峰亦轻微抑制，可能提示其在复合物相互作用中有有限参与；但信号抑制也可能源于弛豫时间变化，需更先进的二维NMR实验方能更有把握地确认相互作用。电镜方面，基于综合表征，Lip45-Rb-磷脂复合物被选作STEM和SEM观察并优先用于后续生物学分析；STEM显示高密度、形貌较均一的纳米级囊泡，粒径在纳米范围（标尺300 nm），与理化表征一致；SEM显示聚集的表面结构，提示囊泡在溶液中可能不稳定，或为SEM样品制备所致。

*Lip45-Rb-磷脂复合物对细胞活力、炎症和上皮屏障完整性的体外评价*：基于Lipoid 45的磷脂复合物因理化与组成特性更优而被用于体外分析。细胞活力方面，0.03125～1 mg/mL剂量反应分析显示，0.5、0.25和0.125 mg/mL浓度下ATP产生显著降低，0.0625 mg/mL显著升高，最高（1 mg/mL）和最低（0.03125 mg/mL）浓度与对照无显著差异；尽管ATP在0.5、0.25和0.125 mg/mL降低，但仍高于未处理对照的75%，提示细胞代谢活性基本保留，故所有浓度均保留用于进一步毒性评估以确定最佳工作浓度。LPS刺激IPEC-J2中的细胞活力与凋亡方面，10 μg/mL LPS单独暴露导致ATP产生显著增加（P < 0.0001）、caspase-3/7产生减少（P = 0.0180），提示对LPS刺激的促存活或代谢活跃反应；与对照相比多数浓度ATP降低但均高于70%；Lipoid 45空白（1 mg/mL）预处理细胞与对照无显著差异，提示载体本身无不良影响；Lip45-Rb-磷脂复合物对caspase-3/7产生呈浓度依赖性影响，1 mg/mL（P = 0.0002）、0.5 mg/mL（P = 0.0001）和0.25 mg/mL（P < 0.0001）显著增加caspase-3/7，提示凋亡性细胞死亡增强，而较低浓度（0.125、0.0625和0.03125 mg/mL）以及0.15625 mM地塞米松和Lipoid 45空白（LB）与对照相比无显著变化。炎症反应方面，10 μg/mL LPS使IL-8浓度较对照显著升高（P < 0.0001），证实炎症反应成立；地塞米松显著降低IL-8（P < 0.0001），验证其阳性对照作用；1 mg/mL Lipoid 45载体（LB）在LPS暴露后无显著变化；所有测试浓度（1～0.03125 mg/mL）的Lip45-Rb-磷脂复合物均显著降低IL-8产生（P < 0.0001），其中三个较低浓度（0.125、0.0625和0.03125 mg/mL）尤为有效，使IL-8较LPS刺激对照降低约40%，恢复至接近基线水平。基于ATP、caspase-3/7和IL-8结果，后续分析将浓度范围缩小至三个较低浓度。基因表达显示，10 μg/mL LPS引起IL-8（P < 0.0001）、IL-6（P < 0.0001）和TLR4（P < 0.0001）显著上调；0.125 mg/mL Lip45-Rb-磷脂复合物预处理较LPS单独暴露显著降低IL-8（P < 0.0001）、IL-6（P < 0.0001）和TLR4（P = 0.0002）表达；较低浓度（0.0625和0.03125 mg/mL）在各靶标上反应不一：IL-8表达均下降但无统计学显著性，IL-6在两浓度下均显著降低（P < 0.0001），TLR4在0.0625 mg/mL（P = 0.0008）和0.03125 mg/mL（P = 0.0069）显著下调；地塞米松显著降低IL-8（P = 0.0171）和IL-6（P < 0.0001）表达，TLR4表达虽降低但未达统计学显著性。紧密连接基因表达方面，10 μg/mL LPS使claudin-4表达下降约45%，提示屏障完整性受损；地塞米松呈claudin-4表达升高趋势但无统计学显著性；Lip45-Rb-磷脂复合物在0.0625 mg/mL（P < 0.0001）和0.03125 mg/mL（P = 0.0017）显著上调claudin-4表达，0.125 mg/mL作用最明显，且效果优于地塞米松，提示不仅保护屏障完整性，还可能通过显著上调claudin-4发挥修复作用。

**讨论与结论**

讨论部分指出，植物化学物作为植物性膳食来源中的生物活性次级代谢产物，具有抗氧化、抗炎和抗菌作用，但被机体识别为异源物质而影响其生物利用度、可及性和生物功效。路易波士黄酮因分子结构较大、多环而水溶性差、生物利用度有限，阻碍跨肠上皮细胞转运。磷脂复合物作为先进的脂质递送系统，活性植物成分与磷脂（通常为磷脂酰胆碱）结合形成分子复合物，可增强膜相容性、改善吸收和生物活性。本研究比较两种食品级卵磷脂磷脂复合物，Lip45-Rb-磷脂复合物在多数参数上更优：粒径更小更稳定（71.79 nm，?43.8 mV），较小颗粒更易被细胞内化、提高胞内植物化学物浓度，且粒径减小使表面积-体积比增大、可能改善载药能力，这可能是其LC较高的原因之一；其EE为74.07%、LC为18.17%，提示更有效的氢键和复合物形成，电镜也从视觉上证实了小球形囊泡。单个黄酮和PPAG的包封随磷脂来源差异显著，Lip45-Rb-磷脂复合物EE较高（68.84%～82.00%），提示与磷脂酰胆碱间键合更强更有效，GR-Soy-Rb-磷脂复合物EE显著较低（25.26%～43.18%），可能源于磷脂酰胆碱纯度和氢键较弱；黄酮丰度与包封率并不成正比，说明高EE取决于磷脂组成、纯度和方法。XRPD、FTIR、DSC和NMR综合分析为路易波士-磷脂复合物成功形成提供了有力证据：磷脂酰胆碱富集材料与路易波士提取物的无定形性质使磷脂复合物呈无定形，复合后晕增宽、峰强度重分布且无明确结晶峰，提示氢键存在和复合物形成，Lip45-Rb-磷脂复合物结构改变更明显，与较高EE一致。100 °C以下宽吸热事件与吸收水分损失一致，无尖锐熔融峰反映无定形性质；磷脂在较高温度（150～190 °C）出现对应于半结晶域熔融和凝胶-液晶相变的吸热转变，磷脂复合物中这些热转变的显著位移、增宽和强度降低提示天然磷脂堆积被破坏并与路易波士多酚建立相互作用；GR-Soy-Rb-磷脂复合物的宽吸热事件也可能源于溶剂残留的增塑效应。FTIR中OH伸缩带位移与增宽提示多酚与磷脂头基间氢键参与，酯羰基峰（1735 cm^?1）强度略降提示分子相互作用而脂质结构完整性保持，PO伸缩带（约1200 cm^?1）变化证实磷酸基团与多酚羟基间相互作用。作者亦指出局限性：缺乏未复合的Lip45 + RbEE物理混合物对照；游离/未复合RbEE与Lip45-Rb-磷脂复合物未在生物活性成分等浓度下直接比较（尽管游离RbEE已在同一细胞模型中评价）。细胞实验中，超过0.125 mg/mL的浓度显著增加caspase-3/7活性，伴随ATP降低，提示较高浓度（1、0.5和0.25 mg/mL）存在细胞毒性，虽也有抗炎作用但限制了其作为安全无毒治疗浓度的潜力；选择三个较低浓度因其生物特征良好（ATP保持在70%以上、caspase活性与对照无显著差异、IL-8显著降低）。1 mg/mL Lipoid 45空白对细胞活力、caspase活性和IL-8产生均无显著影响，但未在低浓度下评估，故不能完全排除载体的浓度依赖性效应。0.125 mg/mL时Lip45-Rb-磷脂复合物降低IL-8、IL-6和TLR4表达的效力优于地塞米松；4 h时仅0.125 mg/mL显著降低IL-8基因表达，而24 h LPS暴露后0.125、0.0625和0.03125 mg/mL均显著降低IL-8蛋白，可能反映IL-8转录与蛋白分泌的不同时间动态，转录后和（或）翻译后调控机制也可能参与，但本研究未直接探究。综上，细胞活力、caspase活性、IL-8蛋白、促炎基因和紧密连接相关基因表达的结果表明Lip45-Rb-磷脂复合物增强了未发酵路易波士的健康促进特性，与日益增多的支持磷脂复合物递送系统用于胃肠道健康的文献一致。结论部分译为：本研究成功开发了一种食品级路易波士-磷脂复合物递送系统，可增强未发酵路易波士提取物（RbEE）的生物学功效。Lip45-Rb-磷脂复合物被确定为更优制剂，其特征为稳定的粒径、高包封率以及经证实的路易波士多酚与磷脂基质间的氢键。在LPS刺激的IPEC-J2细胞中，该磷脂复合物表现出强效抗炎活性，显著降低IL-8蛋白产生并下调促炎基因IL-8、IL-6和TLR4的表达；此外，紧密连接基因claudin-4的显著上调凸显了其恢复肠屏障完整性的潜力。这些结果验证了磷脂复合物包封是一种克服路易波士黄酮固有溶解性和生物利用度限制的稳健技术，本研究为将路易波士-磷脂复合物纳入旨在促进胃肠道健康和管理慢性炎症性疾病的功能性食品奠定了科学基础。未来研究将比较未复合RbEE与Lip45-Rb-磷脂复合物（以相关生物活性成分等浓度归一化），以直接确定磷脂复合物包封对生物学功效的贡献；同时有必要全面评价肠屏障保护活性，包括跨上皮电阻（TEER）、紧密连接蛋白表达及其他屏障完整性指标，以进一步表征路易波士磷脂复合物对肠上皮屏障功能的保护作用。