巴西分类学收藏中蜱（Ixodida: Argasidae、Ixodidae）与恙螨（Trombiculoidae）的Rickettsia spp.分子检测：洞穴与蝙蝠相关蜱螨的遗传多样性

《Experimental and Applied Acarology》：Molecular detection of Rickettsia spp. in ticks (Ixodida: Argasidae and Ixodidae) and mites (Trombiculoidae) from a Brazilian taxonomic collection

　　

Rickettsia spp.是节肢动物宿主的内共生体，按系统发育群和血清学群分类，其生态学具有异质性。本研究旨在筛查保存于巴西米纳斯吉拉斯联邦大学分类收藏中心蜱螨收藏（Acarological Collection at Center of Taxonomical Collections at Universidade Federal de Minas Gerais, Brazil）的蜱和螨中Rickettsia的发生情况，并提供宿主与细菌的遗传数据。对蜱类内源性线粒体标记以及恙螨类线粒体和核基因进行测序，用于样本质量控制和物种鉴定。共获得38只软蜱（Ornithodoros属，至少6个推定种）、18只硬蜱（Amblyomma属，7种）和52只恙螨（Whartonia属，2种）的序列。针对柠檬酸合酶（gltA）基因片段的聚合酶链反应（PCR）获得21条序列，分别归入Bellii、Spotted Fever和Transitional系统发育群；其中1条Rickettsia序列来自Amblyomma dubitatum（鉴定为Rickettsia bellii，R. bellii），8条来自Ornithodoros（分为6个gltA基因型，关联Bellii、Spotted Fever和Transitional系统发育群），12条与Whartonia pachywhartoni相关（3条可能属于Spotted Fever群，9条属于Transitional群）。鉴于Ornithodoros中Rickettsia发生的多样性，特别是9个gltA基因型中有4个仅在已知可叮咬人类的Ornithodoros fonsecai（O. fonsecai）中检出，与洞穴和蝙蝠相关的Rickettsia的医学相关性尚需进一步研究。

论文主体解读：

Rickettsia spp.（立克次体属物种，spp.为种复数缩写）为节肢动物宿主的内共生体，属α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）立克次体目（Rickettsiales），多为专性胞内菌，因氨基酸和核苷酸合成通路缺失而难以在细胞外存活，实验室操作和传统研究困难；部分种可致严重疾病，因而医学关注高。其宿主和感染机制多样，主要经蜱、螨和昆虫叮咬传播，系统发育和血清学上可分斑点热群（Spotted Fever group, SFG）、过渡群（Transitional group, TRG）、斑疹伤寒群（Typhus group, TG）、Canadensis群（CG）、Bellii群（BG）及Scapularis、Adalia、Helvetica、Meloidiae、Rhyzobius等较少谱系。恙螨类（Trombiculoidae）可携带Orientia tsutsugamushi及Orientia属其他成员，也常检出Rickettsia，巴西、美国、斯洛伐克和亚洲多地从小型哺乳动物和鸟类体表恙螨中检出，多数归TRG。自然历史收藏的档案DNA（archival DNA）包括历史DNA（hDNA）和现代DNA，是尚未充分利用的多样性信息源，可提供发生、生态和遗传数据。问题在于：馆藏标本多按形态学目的采集，常先置70%乙醇室温数天至数月，后换无水乙醇于?20 °C保存，DNA降解限制扩增测序；新热带区软蜱科（Argasidae）的Rickettsia记录此前仅15条，研究偏重硬蜱科（Ixodidae）；洞穴和蝙蝠相关蜱螨的Rickettsia医学相关性不清。因此，研究人员以One Health（同一健康）视角，对巴西米纳斯吉拉斯联邦大学分类收藏中心蜱螨收藏（UFMG-AC）中未为分子研究设计的标本进行Rickettsia筛查，旨在提供宿主和细菌遗传数据，并为后续采样和优先区域建立基础。

关键技术方法（≤250字）：标本来自巴西UFMG-AC，共筛查363份，其中蜱158份、恙螨205份，采自米纳斯吉拉斯州、帕拉州和圣保罗州，327份来自洞穴或洞穴相关动物区系。单只标本提取DNA；先形态学鉴定，并测序蜱线粒体16S rDNA（线粒体16S核糖体DNA）、蜱和螨线粒体COI（细胞色素c氧化酶亚基I）及螨核28S rDNA（核28S核糖体DNA）作质量控制和条形码。随后以PCR（聚合酶链反应）扩增Rickettsia gltA（柠檬酸合酶基因）片段，阳性样本尝试16S rDNA、atpA和coxA；产物测序后经BLAST（局部序列比对基本检索工具）比对，采用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）建树，并以PTP（泊松树过程物种界定）分析蜱类界定。

研究结果：

节肢动物宿主鉴定：用16S和COI辅助蜱类鉴定。Argasidae均为Ornithodoros（钝缘蜱属）：25份测16S、20份测COI、7份双标记。Ornithodoros cavernicolous（O. cavernicolous）和Ornithodoros fonsecai（O. fonsecai）经形态和分子确认；O. fonsecai的16S分两个单倍群，来自Itambé do Mato Dentro、Lagoa Santa和Pedro Leopoldo者与Mato Grosso do Sul（Cerrado，模式产地）及Rio de Janeiro（Atlantic Forest）序列相聚，而Caatinga（Pernambuco、Ceará）和Cerrado（Mato Grosso）标本与Luislandia序列相聚；后者较干燥、距其他地点约560 km，显示干湿环境相关分化。Minas Gerais洞穴“Ornithodoros sp. Ubajara”聚支，平均p=0.005，PTP支持同种。6条16S与O. saraivai相聚，但PTP和p=0.079–0.050未能明确归种；1条为O. yumatensis+O. brodyi分支姊妹，p=0.121和0.138，提示新种。COI支持O. cavernicolous、O. fonsecai和Ubajara；O. saraivai中至少3份COI形成独立分支，1条p=0.136且无PTP同种支持；Janaúba两份Ornithodoros sp.与O. cerradoensis聚支，平均p=0.102。Amblyomma（花蜱属）7种：A. brasiliense（N=3）、A. cajennense（N=1）、A. dubitatum（N=1）、A. nodosum（N=1）、A. ovale（N=3）、A. pacae（N=1）、A. sculptum（N=8）。Whartonia中44只为Whartonia pachywhartoni（W. pachywhartoni）、8只为W. nudosetosa。结论是分子与形态结合可确认多数种，并揭示O. fonsecai单倍群、O. saraivai复合体及可能新种。

Rickettsia检测：36份阳性，来自A. dubitatum、Ornithodoros spp.和W. pachywhartoni，均采自洞穴土壤或蝙蝠；获21条gltA序列，归入TRG、SFG和BG，分为9个基因型。基因型1来自A. dubitatum雌蜱，属BG，与R. bellii 100%一致。基因型2来自Ornithodoros sp. 2（O. yumatensis+O. brodyi分支）雌蜱，属BG，与来自中国跳蚤Xenopsylla minax的Rickettsia sp. ALSK 98.94%一致。基因型3来自O. fonsecai雌蜱，属BG，与泰国Dermacentor auratus来源Rickettsia sp. RDa420 99.47%一致。基因型4来自O. fonsecai雌蜱，属TRG，与A. sculptum来源序列99.47%、与R. asembonensis 98.94%一致。基因型5来自O. fonsecai和O. aff. saraivai各1份，在gltA树中为TRG内基部分支，BLAST最高相似为R. parkeri、R. sibirica、R. africae等SFG成员，98.67%。基因型6来自O. fonsecai雌蜱，与R. raoultii、R. conorii等99.20%一致。基因型7来自O. fonsecai和O. aff. saraivai若虫，属SFG，与来自O. hasei的‘Candidatus Rickettsia wissemanii’一致。基因型8有9条，均来自W. pachywhartoni，包括与Carollia perspicillata、Diphylla ecaudata、Mimon bennetti蝙蝠相关幼虫、洞穴地面游离幼虫及1只雄螨，最相似R. australis str. Cutlack（TRG）97.61%。基因型9有3条，来自W. pachywhartoni雄螨，位于铁矿石洞穴暮光区和无光区；BLAST最相似为巴基斯坦Nesokia indica体表Rhipicephalus sp.若虫相关Rickettsia 98.14%，其次为SFG成员97.87%，但gltA树中与TG（Rickettsia prowazekii，R. prowazekii和Rickettsia typhi，R. typhi）为姊妹支。上述结果表明Rickettsia在Ornithodoros中多样性高，且恙螨相关序列分属TRG和SFG。

多位点分析：除基因型9外均获附加标记。拼接57条序列、2966个位点；多位点树总体支持主要群关系，但Canadensis群在ML树未获支持且呈并系。基因型1获4个标记并与R. bellii聚；基因型2、3属BG，2为BG基部分支，3与双翅目等终端聚支且支持较高；基因型6移至BG姊妹位置；基因型4与R. felis聚；基因型8与R. akari聚；其余归SFG，其中5为SFG第二分支，7与‘Candidatus R. wissemanii’聚。结论是单基因与多位点结果大体一致，但部分基因型的位置需多位点数据修正。

讨论部分总结：作者强调，尽管馆藏标本因保存条件导致DNA降解，仍可从分类学收藏中回收细菌多样性，并将地理信息、外寄生虫分类和脊椎动物宿主信息整合起来。蜱类整合分类带来O. fonsecai两个单倍群、Ubajara在Minas Gerais洞穴的丰富分布（包括寄生于Glossophaga soricina）以及O. saraivai复合体和可能新种的线索。Rickettsia多样性可能反映生态多样性，作者提出其与蝙蝠及蝙蝠利用的洞穴有关的假说，需系统采样验证。除A. dubitatum中的R. bellii外，其他Rickettsia多来自Ornithodoros和Whartonia等蝙蝠外寄生虫或洞穴地面生活阶段；部分谱系似为首次在蝙蝠外寄生虫中记录，如基因型2、3和8。洞穴旅游和采矿增加人与洞穴动物接触，O. cavernicolous和O. fonsecai可叮咬人，而O. fonsecai携带9个gltA基因型中的4个，需评估其在新发立克次体病中的潜在作用。研究还指出硬蜱研究较多，而新热带Argasidae的Rickettsia记录此前仅15条，本研究显示其多样性在单一研究中未曾报道；但完全依赖馆藏而非系统采样，限制生态和流行病学推断。

研究结论（摘要）译文：考虑到Ornithodoros中Rickettsia发生的多样性——9个gltA基因型中有4个仅在已知可叮咬人类的O. fonsecai中检出——与洞穴和蝙蝠相关的Rickettsia的医学相关性仍需进一步研究。