《Functional & Integrative Genomics》：Multi-cohort and single-nucleus transcriptomics identify a five-gene lactylation-related panel and a disease-dependent hepatocyte glycolysis–lactylation-related expression program in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis
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赖氨酸乳酸化（lysine lactylation, Kla）将糖酵解通量与蛋白质和染色质调控偶联，但乳酸化相关基因（lactylation-related genes, LRGs）在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-as
赖氨酸乳酸化（lysine lactylation, Kla）将糖酵解通量与蛋白质和染色质调控偶联，但乳酸化相关基因（lactylation-related genes, LRGs）在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH）中的表达景观尚未被绘制。研究人员分析了8个bulk、单核和空间转录组数据集中的320个LRG。在合并的训练队列（51例对照，49例MASH）中，66个LRG差异表达。一个以严重程度为锚的漏斗和四种机器学习算法随后汇聚到一个五基因panel（SIRT1, CEBPZ, TKT, RPL14, CD2BP2）。基于该panel的神经网络在嵌套交叉验证中达到AUC 0.89，并在分类器外部队列中检测出MASH与组织学正常肝脏（AUC 0.90–0.97）。该panel不能区分MASH与单纯性脂肪变性（NAFL），这一边界是所有四个基准化签名（signatures）共有的（AUC 0.50–0.70）。在来自48个肝脏的265,271个细胞核中，LRG表达程序定位于肝细胞，并在Hep3中上升最显著——Hep3是一种甾醇和脂质生物合成状态，在MASH中扩张7.2倍。肝细胞转录组LRG评分在MASH患者中追踪糖酵解（rho=0.93，n=19），但在对照中不追踪（rho=0.01，n=23；差异的P=1.3×10-6）。这种疾病依赖性超过了1,000个表达匹配的随机基因集。Hep3和糖酵解信号在来自4个供体的Visium切片中呈中央静脉周围取向。该panel提供了转录组MASH检测轴，而Hep3中心的程序提供了肝乳酸化的假说，乳酸化组学分析（lactylomic profiling）现在可以检验该假说。
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）影响全球约三分之一成年人，是目前最常见的慢性肝病。其炎症形式——代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是纤维化、肝硬化和肝细胞癌的门户，也是干预最关键的阶段。然而，诊断仍依赖肝活检，该有创操作存在取样误差，难以在风险人群中推广；现有无创检测主要针对纤维化分期而非脂肪性肝炎活动度。因此，可解释且经外部验证的转录组MASH检测工具仍属未满足的临床需求。乳酸（lactate）已从代谢副产品转变为信号分子；赖氨酸乳酸化（lysine lactylation, Kla）于2019年首次在组蛋白上被发现，将糖酵解通量直接偶联至基因调控，这对以肝脏代谢重编程为特征的疾病具有重要意义。已有研究显示，破坏线粒体丙酮酸输入可提高肝乳酸并驱动脂肪酸合酶乳酸化，促进体内脂肪变性；人类肝脏乳酸化组（lactylome）也已公布。但系统层面仍有缺失：尚无研究描绘哪些乳酸化相关基因（LRGs）在MASH中失调、哪些细胞和细胞状态承载该表达程序，或该程序能否用于疾病检测。
研究人员整合了8个公共数据集，包括三个队列合并的训练集、两个RNA-seq评价队列、一个健康至肝细胞癌（HCC）疾病谱队列、一个48例肝脏的单核RNA测序（snRNA-seq）图谱以及人类肝脏Visium空间转录组切片。他们从320个经人工整理的LRG出发，通过预定义的严重程度漏斗和四种机器学习算法的一致性交集，得到五基因panel（SIRT1、CEBPZ、TKT、RPL14、CD2BP2），并在多个队列中验证其检测MASH的性能；随后将LRG表达程序定位于肝细胞及其亚状态，分析其与糖酵解的关系，并通过孟德尔随机化、共定位、双引擎虚拟扰动等方法探讨调控与因果证据。该研究的主要意义在于：提供了一个可解释的转录组MASH检测轴，并提出了一个以Hep3状态为中心的肝乳酸化假说，为后续乳酸化组学（lactylomics）和实验研究奠定了基础。
关键技术方法可概括为：对训练队列（GSE33814、GSE48452、GSE89632；共51例对照、49例MASH）进行合并与ComBat批次校正，利用limma进行差异表达分析；通过ssGSEA计算转录组LRG评分；采用严重程度锚定漏斗（基于GSE135251中NAS和纤维化的相关性）筛选特征，并应用LASSO、SVM-RFE、XGBoost和Boruta四种机器学习算法取交集；构建单隐层神经网络（neuralnet）用于分类评估；对GSE289173的48例肝脏snRNA-seq数据依次进行DecontX去污、DoubletFinder去双细胞、Harmony整合和细胞类型注释；采用伪bulk limma验证；使用Geneformer和scTenifoldKnk进行虚拟扰动；应用孟德尔随机化（eQTLGen/FinnGen）和共定位分析；以及药物签名逆转分析。评价队列包括GSE135251（n=216）和GSE126848（n=57），空间转录组使用GSE192741的5个Visium切片（来自4个供体）。
**乳酸化相关基因在MASH肝脏中广泛失调，其复合评分追踪组织学严重程度**：通过训练队列的差异表达分析，鉴定出66个失调LRG（40个上调、26个下调），其中SIRT1信号最强；这些基因富集于氨基酸生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生等通路。在GSE135251中，LRG评分与NAFLD活动度评分（NAS）及纤维化分期呈正相关，并沿健康至HCC疾病谱逐步升高。
**四算法共识定义五基因LRG panel，具有队列一致的效应方向**：严重程度漏斗将候选基因缩减至25个，四种算法（LASSO、SVM-RFE、XGBoost、Boruta）的交集恰好为SIRT1、CEBPZ、TKT、RPL14、CD2BP2五个基因。跨五个队列的随机效应元分析显示，五个基因的效应方向一致，其中SIRT1下调幅度最大，RPL14异质性最低。
**该panel在分类器外部队列中检测MASH，并与已发表签名正面竞争**：在GSE135251中，五基因神经网络检测MASH与组织学正常肝脏的AUC为0.90（逻辑回归为0.97），但MASH与单纯性脂肪变性（NAFL）的区分AUC仅0.61；在GSE126848中性能较低。与三个已发表MASLD相关签名在同一管道下比较，所有签名均不能有效区分MASH与NAFL（AUC 0.50–0.70），说明这一局限性是领域共性的。
**五基因列线图在个体水平总结panel，并且panel嵌入MASH免疫微环境**：基于五个z评分基因构建的逻辑回归列线图具有较高的表观C-index（0.976），但未进行独立验证。免疫分析显示MASH肝脏免疫微环境重塑，11个CIBERSORT免疫细胞亚群和9个ssGSEA免疫签名存在差异；panel基因与M2巨噬细胞、活化肥大细胞等存在显著关联。
**单核分析将panel定位于肝细胞，并识别出一个扩增的肝细胞状态，其LRG评分与糖酵解呈疾病依赖性偶联**：对48例肝脏的265,271个单核进行分析，发现LRG表达程序主要在肝细胞中上调，TKT在MASH肝细胞中升高3.1倍，SIRT1降低。重新聚类出七种肝细胞状态，其中Hep3（富含甾醇和脂质生物合成基因）在MASH中扩增7.2倍。肝细胞LRG评分与糖酵解评分在MASH患者中高度相关（rho=0.93），而在对照组中无相关（rho=0.01），该疾病依赖性超过1000个表达匹配的随机基因集；空间转录组进一步显示Hep3和糖酵解信号呈中央静脉周围分布。
**MASH重塑肝脏细胞通讯，双引擎虚拟扰动收敛于panel的调控逻辑**：CellChat分析发现MASH中SEMA6、CD6、NOTCH等通路特异性激活，星状细胞获得最多的差异互作。Geneformer虚拟扰动显示CEBPZ和SIRT1过表达可显著将MASH肝细胞嵌入向量推向健康状态，而缺失则朝相反方向；scTenifoldKnk对SIRT1的虚拟敲除靶点富集于MASH差异基因，涉及铁调素、CRP及氨基酸代谢通路。
**遗传分析不支持panel基因表达的因果作用，调控和药理学层面提出切入点**：双样本孟德尔随机化（血液eQTL工具）和共定位分析均未发现五个panel基因表达对MASLD风险的显著因果证据；肝组织特异性分析仅能工具化CD2BP2，结果亦为空。ceRNA数据库证据提示SIRT1、RPL14和TKT受多种miRNA调控；药物签名逆转筛选则重复提名p38 MAPK抑制剂（TAK-715、VX-745、VX-702）作为潜在逆转MASH表达签名的候选化合物。
**panel与乳酸化机制相关，Hep3程序在bulk去卷积和组织空间中一致**：在训练队列中，去乳酸化酶SIRT1、乳酸产生酶LDHA、乳酸转运体SLC16A1/MCT1及乳酸化写入者CREBBP均在MASH中下调；KAT2A与LRG评分正相关，SIRT1负相关。三个panel基因（TKT、RPL14、CD2BP2）是已报道的人类肝脏乳酸化组底物，SIRT1是已报道的去乳酸化酶。bulk去卷积证实Hep3相对分数与NAS相关（控制肝细胞比例后），空间转录组中Hep3特征和糖酵解评分在脂肪肝切片中均高于健康切片，并呈中央静脉周围梯度。
讨论部分总结：该研究提供两个相互关联的结果——五基因panel可检测MASH（相对于正常肝脏），且LRG表达程序定位于一个在MASH中扩增的中央静脉周围肝细胞状态（Hep3），其与糖酵解的关系取决于疾病状态。SIRT1作为去乳酸化酶在panel中具有特殊位置，其虚拟敲除靶点支持其在铁代谢、急性期反应和氨基酸代谢中的枢纽作用。Hep3不同于既往报道的疾病相关肝细胞（daHep）状态。局限性包括：所有证据均为关联性或计算性，未直接测量乳酸化；孟德尔随机化未提供因果支持；panel不能区分MASH与NAFL；单核图谱仅来自一个数据集，空间分析样本量小。结论部分翻译如下：一个五基因乳酸化相关panel在相同评估下可检测MASH（相对于组织学正常肝脏），并达到或超过已发表签名。潜在的LRG表达程序定位于一个扩增的、中央静脉周围的肝细胞状态，其与肝细胞糖酵解的关系取决于疾病状态。这些结果为MASH提供了转录组检测轴，并为肝乳酸化提供了可检验的假说，乳酸化组学和实验研究现在可以加以验证。
