# 从气相到蛋白限域：牛气味结合蛋白中1-辛烯-3-醇构象景观的表征

《Small Structures》：From Gas Phase to Protein Confinement: Characterizing the Conformational Landscape of 1-Octen-3-ol in Bovine Odorant-Binding Protein

　　

通过其大的高度疏水性结合口袋，气味结合蛋白（OBPs）提供了理想的限域环境，可用于研究小挥发性分子在不同条件下的构象集合。为探究气味分子在气相与凝聚相之间的构象景观如何变化，研究人员分析了1-辛烯-3-醇（OCT）与牛OBP（bOBP）。量子化学（QC）计算与高分辨率微波光谱相结合，用于采样OCT的构象景观。为表征OCT在气相、水环境和蛋白质环境中采样的构象集合，开展了全原子分子动力学模拟。作为支撑性参数化步骤，对OCT的不同部分电荷模型进行了基准测试，确定ATB网络服务器是与参考QC能量景观最一致的选项。与先前观察到的香芹酮结合pOBP的情形相反，水环境展现出与气相和蛋白质环境相匹配的构象空间，表明凝聚相中OCT构象异构体之间的互变势垒较低。此外，经实验验证的气相构象异构体与PDB中共结晶的OCT–bOBP复合物所报道的OCT结构相匹配。结合实验数据，模拟为识别限域环境中挥发性有机化合物（VOCs）的构象子空间提供了通用框架。

**研究背景与问题** 哺乳动物气味结合蛋白（OBPs）是脂质运载蛋白超家族的小型可溶成员，具有高度保守的β-桶折叠，内含大型疏水结合腔，可可逆结合多种挥发性有机化合物（VOCs）。其生理作用虽有争议，但通常被认为协助疏水性气味分子穿过嗅上皮周围的黏液层。OBP的封闭疏水口袋提供了明确的限域分子环境，是研究蛋白限域如何影响柔性气味分子构象行为的理想模型。研究人员此前研究了香芹酮在猪OBP（pOBP）中的构象采样，但香芹酮因刚性六元环仅6种构象异构体，自由度有限。本研究将研究对象扩展至构象景观显著更大的1-辛烯-3-醇（OCT，C₈H₁₆O）。OCT是亚油酸氧化分解产生的丰富VOC，最初从松茸中分离，后于多种真菌、植物、动物及其天然产物中鉴定；其嗅觉阈值极低，具特征性蘑菇香气，俗称蘑菇醇，被FAO/WHO食品法典允许作为调味剂。OCT亦为生态相关的信息化学物质（信号化学物质），在牛体内主要以（R）-对映体形式存在，可吸引采采蝇，并存在于人汗液中吸引包括蚊虫在内的吸血昆虫。OCT虽结构相对简单，但沿碳骨架有六个可旋转单键，构象柔性显著，是研究气味分子从孤立气相到水溶液再到OBP限域环境构象调制的理想模型体系。作为结合伙伴，选择其天然结合伙伴牛OBP（bOBP）。与多数以单体发挥功能的哺乳动物OBP不同，bOBP独特地采用结构域交换的同源二聚体结构；此前研究揭示bOBP缺乏哺乳动物OBP中通过分子内二硫桥稳定单体的两个高度保守半胱氨酸残基，合成引入这两个半胱氨酸突变并恢复第121位Gly残基可将bOBP转化为稳定单体。OCT是bOBP的天然配体，亦在牛呼吸气中鉴定，并与bOBP共结晶（PDB-ID: 1GT3）。研究人员的假设是OBP帮助气味分子跨越空气–黏液屏障，即促进从气相直接进入水环境的变化；并假定与气相和鼻黏液相比，OBP可能影响OCT在蛋白结合位点内采样的构象集合。尽管理论研究众多，气味分子在到达嗅觉受体前如何被转运和加工的确切分子机制仍不清楚，气味分子与生物靶标相互作用期间的构象偏好研究不足。为此，研究人员设计了将多尺度计算框架与高分辨率分子束傅里叶变换微波（MB-FTMW）光谱相结合的独特方法。该孤立气相实验可基准化量子化学计算，进而为分子动力学（MD）模拟参数化OCT，是鉴定气相VOCs中最丰富最低能构象异构体的首选方法，已成功应用于多种生物活性化合物。因此，OCT的MD模拟在三种不同环境中进行：气相、显式水（代表鼻黏液）以及bOBP结合口袋内。结合已解析的OCT–bOBP晶体结构（PDB-ID: 1GT3），该多尺度框架可全面描述限域环境中的OCT。需注意，因工作主要聚焦结构表征，即OCT在蛋白环境中的构象采样，研究人员使用已报道的稳定三重突变体bOBP单体结构（PDB-ID: 2HLV）建模OCT–bOBP复合物，其尺寸小于二聚体且计算需求较低；准确评估OCT经bOBP的生物摄取与释放机制时二聚体形式最为相关，但超出本工作范围。

**主要技术方法** 采用MB-FTMW光谱（4.0–26.5 GHz，宽带8.7–13.7 GHz，氦载气）记录OCT气相转动光谱；QC计算经AM1/PM6半经验优化后于B3LYP/6-311G(d,p)水平优化58个独特构象，最低能构象再于MP2/6-311++G(d,p)水平重优化；以AMBER力场对7种电荷模型（AM1-BCC、Gasteiger、Hirschfeld、Merz–Kohn、Mulliken、NPA、ATB）基准测试；用AutoDock Vina进行分子对接；GROMACS进行气相、水相及bOBP–OCT复合物MD模拟（各10×50 ns，含卷曲与伸展构象）；gmx_MMPBSA估算结合自由能并做逐残基分解。样本为市售OCT（98%对映体混合物，abcr），蛋白结构取自PDB（2HLV、1GT3）。

**研究结果**

*2.1 气相——微波实验对鉴定最丰富构象异构体至关重要* 通过系统旋转六个sp³ C–C单键产生729个起始几何结构，经AM1/PM6筛选得58个独特构象并于B3LYP/6-311G(d,p)优化，最低6个构象异构体（相对能差<10 kJ mol^?1）再于MP2/6-311++G(d,p)优化，均呈现至少前4个碳原子的完全伸展烷基链。预测谱初用XIAM半刚体转子模式对三个最低能构象失败，参考Fraser等对n-辛烯的伸展构象研究后改用构象异构体5的转动常数，成功指认强a型R支并纳入b、c型跃迁，81个跃迁纳入拟合，标准差1.9 kHz（实验不确定度约2 kHz），未观察到甲基内旋转导致的谱线分裂。实验观测的最丰富构象亦为QC最低能构象，但该构象在初始采样中被遗漏，仅于指认微波谱后经势能扫描鉴定，凸显气相实验的重要性；其与Fraser等报道的辛烯骨架结构一致，亦符合Suhm等关于烷烃仅在C₁₅后才开始折叠的观点。

*2.2 电荷模型基准测试——经实验验证的QC计算支持选择OCT参数化电荷模型* 以QC优化构象的相对能与AMBER力场对应相对能比较，采用决定系数（R²）与残差方差为指标。ATB衍生电荷模型总体一致性最佳（R²=0.49，残差方差5.95），故用于生产模拟。全部58个构象呈中等相关；限于10 kJ mol^?1内24个构象时一致性显著改善，残差方差由5.973降至3.975。以C1–C8端到端距离评估显示低能态偏好更伸展区域，最低能结构主要位于约7.5–8.6 ?。

*2.3 构象采样——OCT在各环境中保持构象柔性且群体偏好不同* 对卷曲与伸展OCT在真空、显式水及结合口袋中进行MD，计算溶剂可塑表面积（sasa）、回转半径（R_g）与C1–C8端到端距离，并以核密度估计（KDE）可视化；另运行3个无配体bOBP副本，显示β-桶尺寸未因OCT存在而显著改变。端到端距离分布表明OCT在各环境均可及相似构象态，但相对群体受环境影响：水相中20个副本一致，主峰约0.8 nm、次峰约0.9 nm，实验气相构象（0.857 nm）落在可及范围内但不与主群体重合；真空中分布更宽且明显多峰，卷曲与伸展态采样频率相当，实验参考距离位于两主群体之间；蛋白结合模拟副本间变异最大，提示空腔可容纳多个构象亚态且其相对群体依赖局部蛋白–配体环境，此与香芹酮–pOBP不同。OCT构象间相对能更接近、互变势垒较小且受环境影响不大，故更易被布居。所有环境中两个主峰约位于0.81与0.88 nm；0.81 nm±0.005 nm内包含卷曲与伸展多种结构基序，0.88 nm±0.005 nm内均为伸展构象，与QM低能构象一致。对伸展构象（C1–C4距离0.54±0.01 nm）经Boltzmann反演得自由能剖面，与B3LYP/6-311G(d,p)二面角扫描势能曲线叠加，识别出相同的三个宽构象区域（I–III），其中II与III端到端值相同；实验气相结构对应二面角120°的构象异构体II，支持该势能井为物理相关态。力场能再现二面角坐标附近的总体构象，势阱深度与势垒差异源于力场参数化水平较低（多为Hartree–Fock）及MD分布与QM静态扫描的差异。

*2.4 蛋白复合物——逐残基能量分解鉴定OCT结合关键贡献* MM/PBSA估算OCT–bOBP复合物平均结合能为?12.47±0.19 kcal mol^?1（SEM），表明有利复合物形成。分解显示范德华相互作用为主导稳定贡献（VDWAALS=?23.17±0.13 kcal mol^?1）；直接静电有利（EEL=?4.37±0.28 kcal mol^?1）但被不利极性溶剂化能（EPB=+17.64±0.29 kcal mol^?1）抵消；非极性溶剂化贡献小且有利（ENPOLAR=?2.57±0.00 kcal mol^?1）。逐残基分解中配体残基贡献有利（?9.04±0.07 kcal mol^?1）；受体残基中PHE89贡献最有利（?0.53±0.02 kcal mol^?1），而ASN87（+0.67±0.03 kcal mol^?1）与GLU117（+3.86±0.11 kcal mol^?1）贡献不利，GLU117为最大去稳定残基。

*2.5 蛋白复合物——与晶体结构比较揭示bOBP结合口袋中的伸展OCT构象* 与bOBP共结晶的两个OCT结合构象均呈与气相最丰富构象相似的伸展几何。分子对接显示伸展构象契合疏水口袋并与参考晶体结构（PDB-ID: 1GT3，杂原子代码3OM）对齐，蛋白环境通过氢键与八个疏水相互作用容纳配体，与疏水碳链埋藏于以疏水为主的口袋及溶剂暴露减少一致，MD轨迹中该连接持续存在。bOBP二聚体每蛋白单元含一个OCT，共两个实验解析构象；将两者作为起始几何于B3LYP/6-311G(d,p)优化，均收敛至超声射流条件下最丰富的同一构象，提示bOBP空腔可容纳内在偏好伸展构象的替代构型。柔性及固定构象对接产生多个位点聚类姿态，最高评分姿态位于空腔内多个位点。

**讨论与结论** 本研究整合量子化学计算、MD模拟与结合自由能分析，表征了OCT在气相、溶剂化及蛋白结合环境中的构象景观：QC优化结合微波光谱鉴定出最丰富构象呈完全伸展碳链，高精度光谱常数验证了QC模型；经实验验证的QC结构用于基准分子力学电荷参数化，确定ATB拓扑静态电荷分布最准确；MD轨迹表明OCT在三种相中均探索整个构象景观，但各构象相对群体受环境影响强烈，蛋白结合态构象变异性最大；伸展构象C1–C4二面角频率分布的Boltzmann反演与QC势能面相似；MM/PBSA表明OCT与bOBP形成热力学有利复合物，结合主要由范德华相互作用驱动，静电稳定部分被极性去溶剂化惩罚抵消；逐残基分解确定PHE89为主要稳定残基，GLU117贡献最大不利相互作用；bOBP空腔可容纳多种OCT几何包括相对伸展构象，表明蛋白并非强加单一刚性配体结构；两个不同晶体学几何经QC优化收敛至实验气相最小值，提示空腔可容纳内在偏好伸展构象的替代构型。总之，这些结果支持OBP空腔可作为选择性分子环境，重塑而非简单保持柔性气味分子的构象集合。更广泛而言，本工作证明将高分辨率气相实验与原子模拟和结构生物学相结合，可识别蛋白环境中柔性小分子物理相关的构象子空间，并可用于验证CREST、GOAT等其他构象采样技术能否直接识别实验观测结构。