DBP时钟输出基因通过CCL5-CCR5信号通路调控骨骼肌胰岛素敏感性的昼夜节律波动

《Journal of Diabetes Investigation》：The clock-output gene DBP regulates muscle insulin sensitivity and its fluctuations

　　

摘要专业翻译 目的： 昼夜节律紊乱与代谢性疾病密切相关，然而时钟基因在葡萄糖代谢中的作用仍不清楚。D-box结合蛋白（D-box binding protein，DBP）是一种时钟输出基因，可激活D-box，研究人员利用全身性Dbp基因敲除（knockout，KO）小鼠探究DBP在葡萄糖代谢中的作用。 方法： 研究人员建立了两个独立的KO小鼠品系。在授时时间（zeitgeber time，ZT）1和ZT13对13周龄雄性小鼠进行腹腔胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）。为评估肝脏和肌肉的胰岛素敏感性，研究人员检测了2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2DG）含量和AKT磷酸化水平，并对肌肉组织进行转录组分析。 结果： 在KO小鼠中，ZT1时IPITT显示其胰岛素敏感性较野生型（wild-type，WT）小鼠增强，但ZT13时无此差异。这些发现表明，WT小鼠的全身胰岛素敏感性在一天中呈现波动，而KO小鼠则无此波动。ZT1时KO小鼠腓肠肌（gastrocnemius muscle，GM）的葡萄糖摄取和AKT磷酸化增加，但肝脏无此变化。KO小鼠非活动期血浆非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）水平降低。肌肉转录组分析显示，趋化因子和细胞因子相关通路富集最为显著，包括C-C基序趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）及其受体C-C趋化因子受体5型（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）。 结论： 肌肉胰岛素敏感性呈现昼夜波动，在非活动期降低。本研究证明DBP缺失抑制了肌肉胰岛素敏感性的昼夜节律波动，其机制可能涉及血浆NEFA和CCL5-CCR5信号通路。DBP在肌肉胰岛素敏感性的昼夜节律调控中发挥重要作用。

论文解读

一、研究背景与研究意义

昼夜节律紊乱已被大量流行病学研究和基础实验证实与代谢性疾病的发生发展密切相关。人体内部生物钟受光照刺激和食物摄入的调节，轮班工作者罹患2型糖尿病的风险显著增高。骨骼肌作为胰岛素介导葡萄糖摄取的主要外周组织，其外周时钟与中枢时钟同步，在代谢调控中发挥关键作用。尽管已有研究表明肌肉胰岛素敏感性存在昼夜波动，但时钟基因如何调控肌肉胰岛素敏感性这一问题尚未阐明。核心昼夜节律转录因子CLOCK和BMAL1已被报道可调控小鼠肌肉胰岛素敏感性，而作为核心时钟基因下游靶基因的DBP和E4启动子结合蛋白（E4BP4）在肌肉胰岛素敏感性中的作用却从未被探索。DBP通过D-box激活众多基因的转录，E4BP4则竞争性结合D-box并抑制DBP依赖的转录活性，二者在mRNA和蛋白水平呈现相反相位波动，从而增强昼夜振荡幅度。此前研究已利用组织特异性E4BP4过表达系统证明二者在调控胰岛素分泌和胰岛素敏感性中发挥关键作用，但DBP和E4BP4在骨骼肌胰岛素敏感性中的具体功能仍属空白。基于此，研究人员建立了两种独立的DBP基因敲除小鼠品系，系统探究DBP在肌肉胰岛素敏感性昼夜节律调控中的角色。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过全身性敲除Dbp基因，发现KO小鼠在非活动期（ZT1）表现出增强的胰岛素敏感性，而在活动期（ZT13）无显著差异，表明WT小鼠的全身胰岛素敏感性在一天中呈现波动，而KO小鼠的胰岛素敏感性则持续处于较高水平。进一步的组织特异性分析表明，这种增强的胰岛素敏感性主要源于骨骼肌而非肝脏——KO小鼠在ZT1时腓肠肌的AKT磷酸化水平和2DG摄取量均显著增加，而肝脏无此变化。血浆NEFA水平在WT小鼠非活动期早期（ZT4）出现峰值，而KO小鼠中这一峰值消失。肌肉转录组分析揭示趋化因子和细胞因子相关通路显著富集，其中CCL5及其受体CCR5的表达在WT小鼠中随活动-休息周期呈现昼夜振荡，而KO小鼠中这一振荡消失。功能实验证实，WT小鼠来源的原代肌管在电脉冲刺激后CCL5分泌减少，而KO小鼠来源的肌管无此反应；使用CCR5拮抗剂Met-RANTES可部分逆转KO小鼠增强的胰岛素敏感性。这些结果确立了DBP作为调控肌肉胰岛素敏感性昼夜节律的关键时钟输出因子，揭示了昼夜节律输出信号、脂肪酸代谢与细胞因子/趋化因子介导的代谢调控之间的全新联系。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了多种关键技术手段。动物模型方面，建立了两种独立的小鼠品系：一是从EMMA购买的B6;129P2-Dbp^tm1Schb/Cnrm冻存胚胎重新衍生的F-KO小鼠（C57BL/6×129混合遗传背景），二是通过CRISPR/Cas9基因编辑靶向外显子2和3生成的CR-KO小鼠（C57BL/6背景），以排除遗传背景对表型的影响。功能评估方面，采用腹腔胰岛素耐量试验（IPITT）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和丙酮酸耐量试验（PTT）评估全身糖代谢；通过检测2DG摄取量和AKT磷酸化水平分别评估肌肉和肝脏的胰岛素敏感性。分子机制研究方面，对腓肠肌进行全转录组RNA测序（RNA-seq）分析，使用DESeq2鉴定差异表达基因，通过KEGG和GO富集分析及Cnet图揭示相关通路；利用免疫荧光显微镜检测CCR5蛋白表达；分离原代成肌细胞并进行电脉冲刺激（EPS）实验，通过ELISA检测CCL5分泌变化；使用红外感应系统监测自主活动；通过腹腔注射Met-RANTES进行CCR5的药理学阻断实验。

四、研究结果

全身性DBP缺失不影响葡萄糖耐量但损害胰岛素分泌。 通过RT-PCR确认Dbp mRNA在WT小鼠肝脏和腓肠肌中表达且在ZT12达峰，而KO小鼠中完全缺失。KO和杂合（HET）小鼠在体重和随机血糖方面与WT小鼠无显著差异，但KO小鼠在16周龄时血浆胰岛素水平显著降低。OGTT中KO小鼠尽管在葡萄糖负荷后30分钟胰岛素水平显著降低，但血糖水平与WT无显著差异。PTT中KO小鼠在丙酮酸注射后60分钟血糖显著高于WT，提示肝脏糖异生增加。

KO小鼠在非活动期表现出增强的胰岛素敏感性。 ZT1时F-KO和HET小鼠IPITT血糖水平显著低于WT，而ZT13时无显著差异。CR-KO小鼠在ZT1时胰岛素注射后120分钟血糖显著降低，ZT13无差异，证实该表型不依赖于遗传背景。

骨骼肌而非肝脏参与KO小鼠增强的胰岛素敏感性。 ZT1时KO小鼠腓肠肌pAKT/AKT水平显著升高，肝脏无变化；ZT13时二者均无显著差异。ZT1时KO小鼠腓肠肌2DG积累增加，肝脏无增加；ZT13时无显著差异。WT小鼠血清NEFA在ZT4出现峰值，KO小鼠中无此峰值。食物摄入在两种基因型间无显著差异。

肌肉RNA-seq揭示CCL5-CCR5信号通路显著改变。 比较WT小鼠ZT0与ZT12的差异表达基因（1072个上调）和F-KO与WT在ZT12的差异表达基因（1354个下调），发现934个重叠基因。KEGG富集分析显示这些基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路。CCL5与CCR5的表达高度相关（r=0.8908）。外周血单核细胞（PBMC）RNA-seq未检测到趋化因子和细胞因子的显著变化，提示肌肉组织中CCL5表达改变并非源于免疫细胞浸润。

Ccl5和Ccr5在WT肌肉中随活动-休息周期振荡，而F-KO肌肉中无此振荡。 WT小鼠中Ccl5和Ccr5 mRNA在非活动期（ZT0-ZT12）升高，KO小鼠中无此模式。蛋白水平上，KO小鼠腓肠肌CCR5在ZT4（非活动期）较WT升高，ZT16（活动期）降低，免疫组化染色结果一致。自主活动在两种基因型间无差异。WT来源的原代肌管在电脉冲刺激后CCL5分泌减少，KO来源的肌管无此变化。基于H3K27ac峰和JASPAR 2024数据库预测，DBP可能直接调控Ccl5而非Ccr5的表达。Met-RANTES（CCR5拮抗剂）可部分抵消HET小鼠（10μg）和F-KO小鼠（20μg）增强的胰岛素敏感性。

五、讨论与结论

研究人员指出，DBP KO小鼠尽管存在胰岛素分泌减少和肝脏糖异生增加，但葡萄糖耐量得以维持，主要归因于肌肉胰岛素敏感性的增强。这一表型与Clock^Δ19突变小鼠和全身性Bmal1缺陷小鼠的表型高度相似。DBP mRNA在ZT12达峰，提示DBP依赖性CCL5调控在活动期最强。KO小鼠中DBP依赖性抑制因子在非活动期减少，导致肌肉组织中CCL5浓度在非活动期不下降，这可能是KO小鼠在非活动期维持高肌肉胰岛素敏感性的因素之一。CCR5缺陷小鼠葡萄糖耐量受损的报道支持CCL5-CCR5信号增强有助于KO小鼠肌肉胰岛素敏感性提高的结论。研究局限性包括：DBP为全身性敲除，非肌肉组织的贡献无法完全排除；DBP是否直接结合Ccl5调控区域仍需染色质免疫沉淀测序等实验验证。研究结论表明，DBP是通过调控脂肪酸代谢和趋化因子信号来支配肌肉胰岛素敏感性的关键昼夜节律输出因子，将分子时钟与肌因子介导的代谢调控联系起来，为理解肌肉功能的时序调控如何影响全身葡萄糖稳态提供了新见解，时间依赖性细胞因子/趋化因子信号可能成为代谢性疾病治疗的潜在靶点。