耳蜗螺旋神经节中小胶质样细胞与卫星胶质细胞标志物随年龄相关的变化

《GeroScience》：Age-associated changes in microglia-like and satellite glial cell markers in the cochlear spiral ganglion

年龄相关性听力损失（ARHL）与噪声性听力损失（NIHL）是最常见的获得性听觉损伤形式。然而，这两种疾病状态下耳蜗免疫微环境是否存在差异，以及该微环境能否被治疗性调控，在很大程度上仍属未知。包裹螺旋神经节（SG）神经元的卫星胶质细胞（SGCs）传统上不被视为免疫活性细胞，其在耳蜗免疫重塑中的作用亦未得到检验。研究人员利用Iba1、Tmem119、Sox2和CD74的双重免疫荧光染色，系统表征了四组小鼠中Iba1+小胶质样细胞和Sox2+卫星胶质细胞的特征，四组分别为：年轻对照组（CTRL）、年轻NIHL组、老年溶剂处理组（Veh）和老年PLX5622处理组（PLX）。在年轻小鼠中，与CTRL相比，NIHL并未显著改变SG中Iba1+细胞的总密度或Iba1+/CD74+共表达水平。相比之下，老年Veh小鼠的Iba1+细胞总密度以及Iba1+/Tmem119+、Iba1+/CD74+和Sox2+/CD74+细胞密度均较CTRL显著增加，Sox2+/Tmem119+细胞亦呈现类似的上升趋势，但在多重比较校正后未达到统计学显著性。为期7天的PLX5622给药方案显著降低了老年PLX小鼠中Iba1+总细胞、Iba1+/Tmem119+、Iba1+/CD74+和Sox2+/CD74+细胞的密度。上述发现揭示了耳蜗SG内免疫及胶质相关标志物阳性细胞密度存在年龄相关差异，并表明PLX5622处理后部分标志物阳性细胞群体减少。尽管年龄与基因型存在混杂因素，且PLX5622可能同时发挥局部和全身效应，这些观察结果仍凸显了耳蜗SG免疫微环境作为ARHL进一步研究潜在领域的价值。

论文解读

一、研究背景与目的

年龄相关性听力损失（ARHL）和噪声性听力损失（NIHL）是两种最常见的获得性听觉损伤形式，尽管病因不同，但二者在病理特征上存在重叠，其潜在机制至今尚未完全阐明。耳蜗传统上被视为免疫豁免器官，但越来越多的证据表明耳蜗积极参与免疫和炎症过程，免疫调节在耳蜗生理和病理中发挥关键作用。然而，NIHL和ARHL病理机制中涉及的特异性免疫细胞类型及其相互作用仍 largely 未知。

耳蜗常驻巨噬细胞表达离子化钙结合适配分子1（Iba1），受集落刺激因子1受体（CSF1R）信号调控。在老化耳蜗中，这些巨噬细胞发生显著扩增和表型活化，包括上调分化簇74（CD74）——一种参与MHC II类抗原呈递的分子，同时也是巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的受体。CD74不仅是活化标志物，在基线条件下还充当组成性稳态受体。此外，部分耳蜗巨噬细胞亚群表达跨膜蛋白119（Tmem119）——中枢神经系统（CNS）小胶质细胞的稳态标志物，提示这些细胞在病理条件下可能呈现小胶质样表型。

卫星胶质细胞（SGCs）是包裹耳蜗螺旋神经节（SG）神经元胞体的外周胶质细胞，传统上不被归类为免疫细胞，其免疫功能长期被忽视。然而，近年研究揭示外周神经系统中的SGCs在病理条件下可参与免疫和炎症反应。本研究旨在系统表征四组小鼠（年轻CTRL、年轻NIHL、老年Veh、老年PLX）耳蜗SG中Iba1阳性小胶质样细胞（MLCs）和Sox2阳性SGCs的免疫表型状态，并评估CSF1R抑制剂PLX5622对老年小鼠耳蜗免疫环境的调控作用。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：采用8周龄C57BL/6年轻小鼠（CTRL组n=4，NIHL组n=4）和24月龄CX3CR1⁺GFP转基因小鼠（Veh组n=5，PLX组n=8）作为研究对象，免疫荧光定量分析每组n=3。噪声暴露采用宽带白噪声（2–20 kHz，115 dB SPL）每天3小时连续2天。PLX5622以2400 ppm浓度通过饮水给药7天。行为学评估包括声惊跳反射（ASR）、前脉冲抑制（PPI）、新物体识别测试（NORT）和Y迷宫测试。组织学分析采用双重免疫荧光染色（Iba1、Tmem119、Sox2、CD74）、耳蜗全封片制备、免疫组织化学（IHC），并使用QuPath和ImageJ-FIJI进行定量分析。此外，利用公共gEAR门户网站的单细胞RNA测序数据分析了Tmem119和CD74在耳蜗不同细胞类型中的表达模式。

三、研究结果

PLX5622高效耗竭耳蜗巨噬细胞及噪声暴露、衰老和PLX5622处理后的行为学评估

在年轻CTRL小鼠中，ASR V-max、PPI V-max和PPI比率在前后测试时间点间无显著差异。NIHL组ASR V-max和PPI比率较噪声暴露前显著降低。老年小鼠中，PLX5622给药后105 dB SPL下的ASR V-max数值下降，但经Holm-?idák多重比较校正后不再显著。NORT中辨别指数（DI）在PLX5622处理后显著降低，而Y迷宫自发交替率无显著变化，但移动距离和速度显著增加。耳蜗全封片显示PLX组GFP⁺细胞较Veh组显著减少，证实PLX5622有效耗竭了耳蜗巨噬细胞。

CSF1R抑制对老年小鼠耳蜗Iba1和Tmem119表达的差异性调控

年轻小鼠中，NIHL后SG、耳蜗螺旋器（OC）和耳蜗外侧壁（CLW）的Iba1和Tmem119表达均无一致改变。老年小鼠中，PLX5622处理降低了SG和CLW的Iba1免疫反应性，OC无明显变化；Tmem119表达呈区域特异性，SG中增加而CLW中减少。定量分析显示老年Veh组总Iba1⁺细胞密度最高，较CTRL显著增加，PLX5622处理后显著降低。Iba1⁺/Tmem119⁺亚群呈现相同模式。

衰老相关的CD74表达Iba1⁺细胞在耳蜗中的扩增及其被PLX5622减弱

SG是各实验组中Iba1和CD74表达最突出的区域。定量分析显示Veh组总Iba1⁺细胞较CTRL显著增多，PLX5622显著降低该群体。Iba1⁺/CD74⁺亚群呈现相同模式，表明CSF1R抑制有效减弱了耳蜗中Iba1⁺/CD74⁺细胞群体。

SG中Sox2/Tmem119双阳性细胞的扩增

SG中Tmem119和Sox2的表达明显强于其他区域。Veh组总Sox2⁺细胞和Sox2⁺/Tmem119⁺细胞数量较年轻组数值增加，PLX5622处理后相应减少，但经ANOVA和多重比较校正后均未达统计学显著，因此被描述为趋势而非确认效应。

SG中Sox2和CD74共表达的年龄依赖性变化

定量分析显示总Sox2⁺细胞和Sox2⁺/CD74⁺细胞存在显著组间效应。年轻组间（CTRL vs. NIHL）无显著差异。老年Veh组Sox2⁺/CD74⁺细胞较CTRL显著增加，PLX5622处理后显著减弱至接近年轻组水平。Sox2⁺/CD74^-单阳性亚群在两个老年组中均显著低于两个年轻组，但Veh与PLX间无差异。

gEAR数据集中NIHL和老化耳蜗的细胞类型特异性Tmem119表达

公共单细胞RNA测序数据显示，年轻小鼠噪声暴露后Tmem119主要在单核细胞中富集；老年耳蜗中Tmem119主要定位于常驻巨噬细胞（M）和Nudt4⁺纤维细胞样支持基质细胞。CD74在Sox2⁺支持细胞中持续可检测，卫星胶质细胞在5月龄成年小鼠开始表达CD74，而施万细胞在所有年龄组均一致表达CD74。

四、讨论与结论

本研究证明了耳蜗SG中Iba1阳性MLCs和Sox2阳性SGCs的免疫及胶质相关标志物表达存在年龄相关差异，并显示PLX5622处理后部分标志物阳性细胞群体减少。NIHL后SG中未观察到显著的免疫表型变化，这可能与动物在噪声暴露后1–2个月才被处死有关，该时间窗旨在捕捉慢性稳定期而非急性损伤反应，不能排除噪声暴露后数天内存在短暂免疫反应的可能性。

Sox2⁺/Tmem119⁺细胞在老年Veh中的数值增加及其被PLX5622减弱值得关注，但未达统计学显著，应视为初步趋势。gEAR数据显示Tmem119表达不限于小胶质细胞/巨噬细胞，也见于纤维细胞样支持基质细胞，因此Tmem119上调可能反映更广泛的衰老相关胶质基因表达转变，而非获得真正的小胶质细胞身份。

CD74在CTRL条件下Sox2⁺/CD74⁺细胞的组成性存在提示CD74可能具有超出抗原呈递的功能。CD74作为MIF受体，其激活可独立于免疫刺激促进细胞存活和自我更新。Sox2⁺SGCs保留干/祖细胞样特性，基线CD74表达可能反映组成性促存活信号程序。老年Veh中Sox2⁺/CD74⁺细胞的显著升高与衰老条件下CD74相关信号改变相符，MIF-CD74模型仍属假设性，需要直接实验证据验证。

PLX5622可能通过局部耳蜗巨噬细胞耗竭、间接全身效应或对其他细胞群体的直接作用产生影响，当前数据无法区分这些可能性。NORT与Y迷宫结果间的差异可能反映范式固有差异或处理对探索、唤醒、动机或运动行为的不同影响。

研究局限性包括：缺乏耳蜗SGCs表达CSF1R的直接证据；依赖ASR/PPI而非直接电生理测量；免疫荧光定量采用二维图像细胞计数而非体视学方法；年龄与基因型存在混杂（年轻组为C57BL/6，老年组为CX3CR1⁺GFP转基因C57BL/6背景）；未进行正式观察者盲法；样本量较小（n=3/组用于免疫荧光定量）。

结论：本研究描述了耳蜗SG中免疫及胶质相关标志物阳性细胞密度随年龄的变化，并表明PLX5622处理可减少部分标志物阳性细胞群体，为ARHL中老化耳蜗SG免疫微环境的进一步研究提供了描述性基础。