《Glycoconjugate Journal》：The status quo and evolution of glycoconjugates for cancer immunotherapy
糖类与糖缀合物（glycoconjugates）在生物体自出生、发育直至死亡的几乎所有生命过程中均发挥重要作用。半个多世纪以来，肿瘤细胞上异常糖基化谱已被广泛讨论。然而，在过去的数十年中，研究人员已证实这些修饰糖类如何通过逃避免疫监视并在肿瘤微环境（TME）中营造免疫抑制性微环境，从而影响肿瘤的发生、进展与转移。尽管肿瘤免疫治疗的进展已显示出前景，但其仅能提高小部分患者的总生存期。由于对复杂肿瘤免疫耐受机制的认识有限，某些类型的肿瘤直至晚期仍无法被诊断和治疗。对糖类与糖缀合物的理解与利用有助于研究人员致力于将肿瘤免疫治疗的获益扩展至更广泛的人群。许多糖类与糖缀合物已进入临床试验，但基于糖类的材料的全部潜力尚未被完全开发。本综述概述了糖缀合物介导的肿瘤免疫治疗领域的主要进展，并特别强调最新进展。在涵盖广泛糖类类别的同时，本综述尝试建立糖缀合物结构与其各类糖类所引发的主要免疫应答之间的相关性。
**引言**
**与肿瘤相关的糖类与糖缀合物概述**
碳水化合物因作为能源及药物组分的基本用途而对所有生物至关重要。聚糖（glycans）作为糖蛋白和糖脂的糖基部分，具有巨大的结构多样性，并在代谢、发育、免疫应答、发病机制及疾病消减等一系列生物学事件中发挥独特作用。通过其糖基组分，糖蛋白和糖脂参与细胞及非细胞水平的相互作用。肿瘤相关糖蛋白如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）和人表皮生长因子受体2（HER2）的鉴定，引领了20世纪60年代基于糖类的生物标志物的早期发展。
糖类在肿瘤生物学中的作用最早于20世纪初被发现，当时在细胞表面蛋白上检测到截短型糖类。同时期的一项开创性发现确立，肿瘤中糖基转移酶（glycosyltransferases）和糖苷酶（glycosidases）的失调驱动了肿瘤细胞表面的糖类截短。此后，糖类与糖缀合物因其在肿瘤发生中的作用及诊疗潜力而受到研究者关注。20世纪50年代，与健康细胞相比肿瘤细胞上改变型糖类的鉴定是一项关键发现，这些改变型糖结构被归类为"肿瘤相关糖抗原（TACAs）"。自肿瘤糖组研究诞生以来，TACAs已被证明通过促进免疫逃逸、增殖、侵袭和转移而参与肿瘤发生与癌症进展。多种癌症类型中已有一系列明确鉴定和表征的TACAs，包括截短型O-聚糖如Thomsen-Nouveau（Tn）、Thomsen-Friedreich（TF）、唾液酸化Tn（sTn）、神经节苷脂（GD2、GD3、GM2、GM3和岩藻糖基-GM1）、唾液酸化Lewis抗原（sLea、sLex和sLey）、Globo系列（Globo-H、SSEA-3和SSEA-4）以及多聚唾液酸。由于这些是"自身"抗原，免疫系统通常更难识别和靶向它们。针对这些肿瘤相关分子标志的开创性方法是开发TACA靶向单克隆抗体（mAbs）。虽然针对GD2的抗体（如dinutuximab）被开发用于神经母细胞瘤，抗MUC1抗体被探索用于乳腺癌和卵巢癌，但一个重大转折点出现在利用多价糖缀合物方法开发合成碳水化合物疫苗之时。
数十年来越来越多的证据表明，TACAs通过与免疫细胞表面的凝集素（lectins）相互作用，积极促进形成敌对的免疫抑制性肿瘤微环境。凝集素是一类结合特定糖基的碳水化合物结合蛋白，已被证明是解析肿瘤糖组不可或缺的工具。由于其特异性结合能力，凝集素被定制为诊断标志物、生物传感器甚至治疗剂。凝集素区分肿瘤与正常组织的能力依赖于其糖基化模式，已使其成为宝贵的肿瘤诊断工具。近年来，凝集素已成为靶向药物递送剂，助力设计和开发具有增强疗效的糖靶向免疫疗法。常用于治疗目的的凝集素包括半乳糖凝集素（β-半乳糖苷结合凝集素）、Siglecs（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素）和C型凝集素受体（CLRs）。半乳糖凝集素在肿瘤细胞上过表达，而Siglecs和CLRs在肿瘤相关免疫细胞表面过表达。对这三类糖结合蛋白的认识为利用糖类和糖缀合物设计免疫治疗干预奠定了基础。
肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞表面碳水化合物结合受体的过表达，为利用不同糖引导缀合物递送细胞毒性有效载荷的研究提供了信息。具体而言，葡萄糖转运体1（GLUT1）、分化簇44（CD44）以及某些凝集素如Siglecs和CLRs已成为单糖/多糖基治疗剂的主要靶点。尽管糖缀合物领域近年有所整合，但基于糖缀合物的肿瘤免疫治疗一直在快速发展。因此，这一特定领域的进展融合需要专门的综述。下文全面概述了为肿瘤免疫治疗开发的众多糖类与糖缀合物。本综述仅重点介绍那些能触发抗肿瘤免疫应答的糖类及糖缀合物。
**糖缀合物介导的肿瘤免疫治疗的作用模式**
肿瘤免疫治疗围绕利用机体自身免疫系统对抗癌症。它涉及增强免疫系统识别和摧毁肿瘤细胞能力的策略，从而赋予更高的特异性和更持久的治疗效果。目前，肿瘤免疫治疗包含五大主要策略：（i）单克隆抗体和双特异性T细胞衔接器（BiTEs），（ii）免疫检查点抑制剂，（iii）过继性细胞转移，（iv）肿瘤疫苗和（v）溶瘤病毒。由于TACAs在肿瘤细胞上的优先表达及其在肿瘤发生中的关键作用，它们为开发预防性和治疗性抗癌疫苗奠定了坚实基础。开发基于糖类/糖缀合物的疫苗及其他免疫治疗方法需要全面理解TACAs如何参与免疫逃逸。糖基系统与免疫细胞的相互作用通过多种机制发生。糖类的物理呈递是其免疫命运的主要驱动因素，以下详述了由大量实验数据支持的多种机制原理：
**（a）TACA模拟物对B细胞的直接激活：**孤立或简单的TACAs，如分离的Tn或TF抗原，在功能上对免疫系统不可见。其低价数阻止了受体交联，无法招募激活所需的细胞辅助。某些特定TACAs，如高度重复或成簇序列（例如黏蛋白MUC1），可直接交联B细胞受体（BCRs），诱导快速的B细胞激活，这被称为"原始"反应。这通常导致短暂IgM应答，这些TACAs被归类为T细胞非依赖性（TI）2型抗原。该TI-2途径以IgM抗体为主，缺乏高亲和力结合所需的体细胞超突变或长期免疫记忆的产生。当TACA模拟物偶联到载体蛋白时，这些应答通过同种型转换为IgG和免疫记忆的形成而增强。糖类所连接载体的基础化学结构决定了所产生免疫应答的"风味"，即环境是促炎还是抑制性。最著名的载体蛋白之一是匙孔血蓝蛋白（KLH），其与TACA单元的偶联促进T细胞辅助招募至初始B细胞应答，提供打破耐受所需的必要共刺激。当免疫系统处理这种TACA-载体复合物时，促进诱导IgG1和IgG3，这两种同种型在介导肿瘤清除方面最为有效。
**（b）模式识别受体（PRRs）的参与：**PRRs是许多先天免疫细胞上的特化受体，识别病原体相关分子模式（PAMPs）作为病原体/非己识别的基序。与许多其他糖基PAMPs一致，肿瘤糖类及其模拟物能够激活巨噬细胞、树突状细胞和抗原呈递细胞上的这些PRRs。在肿瘤免疫治疗背景下主要关注的PRRs是C型凝集素受体（CLRs）和Toll样受体（TLRs），二者均识别特定碳水化合物结构。
CLRs利用其C型凝集素样结构域（CTLD）识别含岩藻糖和甘露糖的糖类，促进钙依赖性糖结合。激活后，CLRs（如DC-SIGN、Langerin、Dectin-1）通过其胞质结构域中的特定基序以不同方式调节免疫应答。根据其信号传导特性，CLRs被分为激活型CLRs（含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAMs）和抑制型CLRs（含免疫受体酪氨酸抑制基序或ITIMs）。广义上，CLRs通过识别特定糖结构充当免疫监视的守门人。糖识别触发先天性和适应性免疫的调节。利用特异性糖识别，研究人员通过设计糖模拟物来靶向CLRs。有趣的是，某些CLRs（如CD205）在特定肿瘤细胞上的异常表达也有报道。
Toll样受体（TLRs）检测包括糖类在内的微生物组分以启动免疫应答。它们表达于先天免疫系统的所有细胞和适应性免疫系统的大多数细胞上。结构上，TLRs是I型跨膜蛋白，其胞外域具有富含亮氨酸重复序列以识别PAMPs。胞内域由Toll-白细胞介素1（IL-1）受体（TIR）结构域组成，通过与IL-1途径的串扰执行下游信号传导。研究人员已发现人类约10种功能性TLRs，具有差异表达模式，对不同配体特异，同时诱导不同靶基因。TLRs的表达不限于巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等免疫细胞。在多种癌症中，其表达延伸至肿瘤细胞，表明TLRs在肿瘤进展和治疗中表现出独特但多方面的作用。由于其在参与先天性和适应性免疫系统中的关键作用，TLRs是肿瘤免疫治疗最有用的抓手之一。TLR7和TLR8因其作为更"免疫活跃"或"热"肿瘤微环境指标的能力而被认为是极具吸引力的靶点。虽然文献中已报道特定TLR7/8激动剂并已进入临床试验，但将其偶联至糖基部分以实现肿瘤靶向的方法具有独特性。传统上，TLR激动剂也偶联至TACAs，导致抗原呈递增强、树突状细胞成熟和T细胞激活。
通过糖抗原参与CLR和TLR的免疫调节影响可用于生成基于糖的免疫治疗剂。有趣的是，免疫系统根据TACA的密度和化学环境来解读其"威胁等级"。需要选择载体蛋白或精确的物理特性集以及抗原呈递的背景，才能将天然弱免疫原性TACA转化为疫苗（产生免疫记忆）。佐剂的选择是决定疫苗将引发细胞免疫还是体液免疫的最重要因素之一。传统使用的佐剂如明矾主要偏向Th2型，即主要驱动体液应答。引发有效细胞毒性T细胞应答的能力存在于Th1主导的佐剂中，如TLR激动剂（MPLA和CpG ODN）和皂苷（如QS-21）。这些佐剂能够确保干扰素-γ（IFNγ）的分泌和细胞毒性CD8+ T淋巴细胞（CTLs）的激活，同时避免抑制性Th2偏倚。认识到单一途径易被肿瘤微环境抑制，现代肿瘤学依赖联合佐剂系统。其中一些包括AS01（QS-21+MPLA）和乳剂（如MF59、Montanide ISA 51）发挥协同效应，从而产生高度稳健的Th1应答和强免疫记忆。
**（iii）通过Siglecs的免疫调节：**Siglecs是一个识别细胞表面唾液酸化糖类的跨膜受体家族。它们主要表达于免疫细胞，包括自然杀伤细胞、T细胞和B细胞亚群、巨噬细胞和树突状细胞。Siglecs在调节免疫应答、维持自身耐受和调节炎症中发挥关键作用。有15种不同的Siglecs，其中大多数具有胞质ITIMs，在激活（唾液酸聚糖结合）后招募SHP磷酸酶并传递抑制信号以抑制免疫细胞活性。Siglecs在肿瘤相关免疫细胞上的表达是调节免疫细胞信号的额外途径，帮助肿瘤逃避免疫监视。肿瘤通过过表达唾液酸化糖类来利用Siglec信号传导，有效抑制抗肿瘤免疫应答。Siglec-15在所有Siglecs中独特，因为它仅显示一个IgV和一个IgC2结构域，与B7家族成员高度同源。某些肿瘤直接表达Siglec-15，例如非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤和鼻咽癌（NPC），它们使T细胞抑制和免疫逃逸成为可能。研究人员观察到Siglec-15在肿瘤细胞（48.3%）和肿瘤相关基质细胞（33.4%）中表达的发生频率高于PD-L1在肿瘤细胞中的表达。由于其在正常（非癌）细胞中的罕见表达以及与癌细胞上PD-L1互斥的表达模式，Siglec-15成为基于糖类疗法的新型免疫逃逸靶点。由于Siglec-15促进免疫抑制性肿瘤微环境（TME），它正被探索作为肿瘤治疗中的新型免疫检查点靶点。恢复抗肿瘤免疫的一种策略是利用唾液酸偶联递送免疫刺激剂以扰动Siglec-唾液酸结合。例如，当TLR激动剂如牛蒡子苷元通过唾液酸修饰的载体递送时，TLR6-NOX2-MAPK轴似乎激活巨噬细胞并恢复被抑制的抗肿瘤免疫。
**（iv）iNKT细胞激活：**观察到恒定自然杀伤T细胞（iNKT细胞）对CD1d呈递的糖脂抗原具有独特识别，CD1d是一种非多态性MHC I样分子。CD1d作为主免疫调节受体的鉴定代表了免疫学的范式转变，从以蛋白质为中心的抗原识别观点转变为给予细胞脂质组应有地位的观点。CD1蛋白最初在20世纪70年代末和80年代初被鉴定为胸腺细胞分化抗原。Milstein及其同事在20世纪80年代中期的严谨研究使人们对人CD1基因座的亚型有了清晰认识。在五个亚型中，CD1d因其在细胞表面呈递脂质抗原的能力而成为参与免疫调节的重要受体。CD1d缺乏多态性表明其能够识别在许多病原体中保守或为必需自身脂质的脂质结构，其功能更像是模式识别受体（PRR）而非传统抗原呈递分子。CD1d的鉴定直接导致了其所限制的T细胞群体的表征。这些统称为自然杀伤T（NKT）细胞，因其常共表达T细胞受体（TCR）和自然杀伤（NK）细胞的典型标志物如NK1.1（CD161）。NKT细胞根据其TCR使用和配体特异性分为两大类：iNKT细胞和多样性NKT细胞。正是iNKT细胞的TCR识别CD1d并处于"效应预激"状态。晚期癌症患者中iNKT细胞数量和功能的显著受损归因于CD1d的同时下调。虽然CD1d作为蛋白质在20世纪80年代中期被克隆和纯化，但直到20世纪90年代中期该"孤儿"受体才与其配体匹配。最初从海洋海绵Agelas mauritianus中作为抗肿瘤化合物筛选的一部分分离，α-GalCer被发现是iNKT细胞的有效激活剂。如Fig. 1d所示，使用糖缀合物如α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）已知可被CD1d特异性呈递并暴露半乳糖以供iNKT细胞TCR识别。这导致iNKT细胞激活并通过直接细胞毒性和免疫协调增强抗肿瘤免疫。
**（v）对选择素介导的免疫细胞和肿瘤细胞运输的影响：**免疫细胞和肿瘤细胞通过血管的迁移在很大程度上由内皮细胞表面的选择素（selectins）调节。选择素被广泛认为是细胞粘附分子，在细胞运输中发挥核心作用。然而，在过去十年中已确立选择素及其配体积极参与调节免疫细胞功能，并贡献与抗肿瘤免疫相关的信号传导。数十年来已鉴定和研究三种类型的选择素：
E-选择素（CD62E），其主要功能是介导免疫细胞和循环肿瘤细胞（CTCs）的粘附和外渗，结合唾液酸化和岩藻糖基化糖类（如唾液酸化Lewis X（sLex）和唾液酸化Lewis A（sLea））。许多侵袭性癌症，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌，表达高水平E-选择素配体，使其能够与内皮细胞上的E-选择素有效相互作用。一些研究表明E-选择素表达也可在肿瘤细胞上被诱导，增强细胞间粘附、免疫逃逸和肿瘤侵袭性。
L-选择素（CD62L）表达于白细胞上，以调节免疫细胞运输而闻名。激活白细胞上L-选择素的快速脱落也在癌症中发挥重要作用。L-选择素参与肿瘤免疫治疗提供了有趣的可能性，特别是因为其在癌症中的矛盾作用，既影响肿瘤进展又影响抗肿瘤免疫。一方面，肿瘤特异性T细胞上L-选择素表达增强已被利用来增强过继性细胞治疗模型的疗效。另一方面，阻断L-选择素的策略已被探索作为遏制转移的途径。因此，L-选择素的双重作用需要谨慎和战略性的治疗建议。
P-选择素（CD62P）表达于血小板、内皮和一些肿瘤细胞上。它促进血小板-肿瘤相互作用，保护肿瘤细胞免受免疫攻击。研究已揭示表达P-选择素的广泛细胞类型，并暗示其在肿瘤转移中的潜在作用。P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）是一种在白细胞上表达的高度糖基化蛋白，主要与P-选择素结合并促成白细胞滚动。此外，PSGL-1作为免疫检查点发挥作用，已知通过驱动T细胞耗竭抑制抗肿瘤免疫，因此被认为是免疫治疗靶点。Lewis抗原模拟物作为疫苗显示可抑制选择素与其相应配体的相互作用。例如（如Fig. 1e所示），Lewis抗原缀合物抑制选择素与免疫细胞上PSGL-1以及肿瘤细胞上表达Lewis抗原的糖蛋白（如黏蛋白）的结合。这一肿瘤免疫治疗分支实现了对肿瘤细胞外渗和转移的控制。
上述五种机制指导了基于TACA的糖缀合物用于肿瘤免疫治疗。另一种利用糖缀合物靶向癌症的方法是使用被肿瘤细胞上过表达的特定碳水化合物结合膜蛋白特异性识别的单糖和多糖。本综述分别详述了这两个分支的进展：基于TACA的免疫治疗糖缀合物和基于单糖/多糖的免疫治疗糖缀合物。它总结了多年来设计的各类糖缀合物，主要关注过去5年中最显著的进展。每个部分以不同类别糖缀合物引发的免疫应答趋势和机制（Fig. 1a-e）的展望作为结论。
像这样一份总体而分类的报告将帮助研究人员确定在使用糖类及其缀合物进行肿瘤免疫治疗时应探索的有前景的方法。由于本综述仅关注诱导免疫治疗应答的糖类和糖缀合物，因此未纳入非碳水化合物治疗材料和其他肿瘤治疗方式。
用于每种单糖的代表性符号的关键描述见Fig. 2。每个小节包括一个图，突出显示针对相应TACA、单糖和多糖报道的不同类别糖缀合物。每种糖缀合物引发的主要免疫应答一并描绘。代表这些缀合物类别的颜色方案如下：橙色：小分子；粉色：疫苗；紫色：纳米颗粒；绿色：抗体偶联物。描述基于TACA的疫苗的图还包括疫苗结构的通用示意图，描绘化学连接子在糖链上的连接点。必须理解，糖类在大分子载体组装体（蛋白质/树枝状聚合物/脂质体）上存在多价呈递，每个载体单元的糖单元确切数量因系统而异，取决于连接子和载体的化学性质以及所用连接化学。
**基于TACA的免疫治疗糖缀合物**
**糖脂上的TACAs——神经节苷脂**
神经节苷脂是一类独特的鞘糖脂，含有神经酰胺脂质骨架，连接以唾液酸残基结尾的糖类。神经节苷脂普遍分布于组织和体液中，但主要丰富于神经组织的质膜，主要参与细胞信号传导、粘附和受体活性调节。结构上，神经节苷脂根据唾液酸残基数量分类：例如GM1、GD1a、GT1b（分别为单、二和三唾液酸化种类）。具体而言，GD2和GM2在神经母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和小细胞肺癌细胞表面过表达。这些神经节苷脂在肿瘤进展、转移和免疫逃逸中发挥关键作用。神经节苷脂已知通过建立免疫抑制性肿瘤微环境来调节免疫应答。肿瘤细胞脱落神经节苷脂可抑制树突状细胞激活和自然杀伤（NK）细胞功能，促进肿瘤免疫逃逸。所有这些特征使神经节苷脂成为免疫治疗的潜在靶点。该领域的早期研究围绕抗体开发，取得了显著的临床前成功。抗GD2单克隆抗体如dinutuximab最近被开发并获得FDA批准用于高危神经母细胞瘤的治疗。除单克隆抗体外，神经节苷脂也正在被研究用于疫苗开发和嵌合抗原受体（CAR）T细胞工程。神经节苷脂疫苗的初步尝试在早期临床阶段显示出成功，特别是对晚期乳腺癌和黑色素瘤。在神经节苷脂疫苗的有希望结果之后，研究人员探索了各种其他多价支架如杯芳烃和碳基纳米材料以增强神经节苷脂模拟物的免疫原性特性。包含GM2-和GD2-KLH的二价疫苗引发了高度有效的免疫应答。在另一项研究中，通过将GD2和GD3与载体蛋白KLH偶联制备的组合疫苗，在与糖佐剂β-葡聚糖共同给药时已被证明能引发强免疫应答。在II期临床试验中，接受该制剂的神经母细胞瘤患者总生存期增强归因于强而稳健的抗体产生。
不久之后，Wu等人证明化学稳定的GD2模拟物9NHAc-GD2与噬菌体Qβ病毒样颗粒偶联是强免疫原性疫苗候选物。在无肿瘤C57BL/6小鼠和比格犬（犬类）中免疫后的血清学分析显示，该候选物能够克服水解不稳定性问题，以及更具免疫原性形式的GD2抗原即9-O-乙酰基-GD2随之而来的临床疗效损失。研究人员还利用多价聚酰胺胺支架（PAMAM）连接神经节苷脂GD2和GD3。PAMAM-GD2和PAMAM-GD3疫苗引发稳健的选择性体液和细胞免疫，其中在C57BL/6小鼠的淋巴瘤和黑色素瘤模型（EL4和B16F10细胞）中观察到CD8+和γδ T细胞的快速扩增。使用OPT-821（QS-21的合成/高度纯化组分）作为主要佐剂，对推进多种多价神经节苷脂疫苗进入II期和III期临床试验起到了关键作用。最近，Rosenbaum等人开发了一种三价疫苗，使用GM2-、GD3L-和GD2L-KLH与OPT-821的组合。显而易见，多年来科学家们尝试将GD/GM糖类锚定在蛋白质载体、免疫原性脂质体、两亲性肽和树枝状聚合物载体上。过去十年见证了神经节苷脂导向疫苗开发的巨大激增，使用神经节苷脂抗原或与其他TACAs组合。值得注意的例子被分类并总结于Fig. 3。
最近，Zhao等人报道了构建用神经节苷脂抗原功能化的噬菌体MX1病毒样颗粒（VLPs）作为有效的肿瘤免疫治疗策略。该研究描述了通过化学酶法合成NHAcGD2和NHAcGD3的异硫氰酸酯衍生物。随后，利用硫脲连接化学将这些衍生物与纯化MX1 VLPs的胺基偶联，产生MX1-NHAcGD2和MX1-NHAcGD3缀合物。在无肿瘤C57BL/6小鼠中免疫MX1-NHAcGD2和MX1-NHAcGD3缀合物显示诱导高IgG滴度，表明强免疫原性。此外，由MX1-NHAcGD2和MX1-NHAcGD3制备的糖疫苗产生的抗体分别对IMR-32神经母细胞瘤细胞和SK-MEL-28黑色素瘤细胞显示高结合特异性。此外，还显示从接种疫苗小鼠提取的血清通过补体介导的细胞毒性有效杀伤相应肿瘤细胞。作者得出结论，这两种疫苗具有在临床水平靶向表达GD2和GD3抗原的癌症的潜力。
与此同时，Romanò等人使用GM3和（Neu5Gc）GM3开发了神经节苷脂功能化纳米颗粒。在神经节苷脂抗原的立体选择性合成之后，作者将其与具有反应性NHS酯的连接子偶联，然后共价偶联至α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）。使用二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和胆固醇与这些糖脂-TACA缀合物混合制备稳定的脂质体纳米颗粒制剂，随后进行脂质挤出以达到<200 nm的均匀尺寸。由于αGalCer是iNKT细胞的已知激动剂，作者使用人树突状细胞（DC）和iNKT细胞进行共培养实验。有趣的是，两种脂质体制剂即含GM3-αGalCer的制剂和含其与（Neu5Gc）GM3-αGalCer组合的制剂均显示改善人DCs上CD1d的呈递，同时显著促进人iNKT细胞的增殖和激活。在表达GM3的B16F10黑色素瘤小鼠模型中，接种疫苗的小鼠显示稳健的IgG应答、CDC介导的肿瘤消退，以及在没有任何外部佐剂的情况下有效的整体抗肿瘤免疫应答。从Table 1可以看出，神经节苷脂已被广泛研究用于疫苗开发二十多年。然而，抗原脱落和潜在脱靶毒性的局限性继续推动对更具战略性方法的需求。
**Globosides**
Globosides构成一类中性鞘糖脂，其特征在于其碳水化合物头基包含半乳糖和N-乙酰半乳糖胺单元。这些糖脂装饰在质膜外叶，参与细胞-细胞识别、粘附和细胞外信号传导。特定globosides如Gb3和Globo H在许多类型的肿瘤细胞上异常过表达，如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌。特别是Globo H在大多数上皮肿瘤中过表达，已被认为是适合设计靶向治疗的众多肿瘤相关糖抗原（TACA）之一。近几十年来，科学家对开发大量globoside基疫苗的兴趣显著增长。最初，该领域的研究看到越来越多的出版物报道使用大肠杆菌表达糖基转移酶，产生高产量的酶，确保globopentaose（Gb5）、Globo H和SSEA-4的大规模合成。化学酶法合成方法也与有效的糖核苷酸再生系统相结合。Wong、Danishefsky及其同事综述了各种Globo系列疫苗的制备细节及其治疗潜力。然而，这些肿瘤疫苗在持续引发强T细胞介导免疫方面面临挑战。
为应对这些挑战，研究人员开始探索完全合成的糖缀合物疫苗，纳入免疫刺激佐剂以增强体液和细胞免疫应答。一些早期报道展示了Globo H鞘糖脂的全合成。随后，研究人员通过将这种预合成的Globo H（GH）与载体蛋白KLH偶联制备合成疫苗。当这些合成疫苗用于小鼠乳腺癌模型时，与佐剂QS-21和牛血清白蛋白（BSA）组合，作者观察到针对乳腺癌细胞MCF7的特异性抗体产生。后来，GH-KLH疫苗与佐剂QS-21一起在人类患者中测试，发现能引发免疫应答。为进一步阐述类似原理，各种载体蛋白包括KLH和白喉类毒素（CRM197）与GH偶联。所得缀合物与合成佐剂α-半乳糖神经酰胺（C34）一起引发强而稳健的抗体产生。值得注意的是，GH-DT/C34疫苗比III期临床疫苗GH–KLH/QS21引发更多IgG抗体，对表达GH、SSEA3和SSEA4的乳腺癌细胞具有增强的特异性。此外，这些发现导致了另一种有效疫苗候选物SSEA4-DT/C34的开发，免疫后产生针对SSEA4的高度特异性抗体。一项机制研究揭示了β1,3-半乳糖基转移酶V（β3GalT5）酶在表达Globo系列鞘糖脂（GSLs）的癌细胞中肿瘤进展和转移的作用。这些发现确立了Globo系列GSLs（SSEA3/SSEA4/Globo-H）与肿瘤中FAK/CAV1/AKT/RIP复合物之间的相关性，展示了基于抗Globo-H和抗SSEA4单克隆抗体协同效应的有效治疗策略。
最近，Wong及其同事通过系统研究Globo H-DT/C-34疫苗的作用机制揭示了其机制作用。作者发现Globo H-DT/C-34缀合物被DCs摄取，经酶处理，随后所得糖类由MHC II类分子呈递，被B细胞识别以产生针对GH和SSEA3糖类的特异性抗体。该研究还讨论了通过树突状细胞MHC-II抗原复合化激活CD4+细胞。此外，该研究清楚证明树突状细胞中的FUCA1酶促去除GH-DT疫苗的末端岩藻糖以产生SSEA-3和修饰糖类用于呈递。进一步，作者通过使用昆虫细胞纯化的半乳糖基转移酶β3GalT5-1改善了Gb4向Gb5（SSEA-3）糖类的转化。先前已知的微生物葡萄糖转移酶LgtD最近被用于Gb4向Gb5的转化，尽管产量中等。该研究通过鉴定对人β3GalT5的两种同工酶（对在癌细胞中产生GH系列糖类至关重要），随后进行丙氨酸扫描诱变，展示了有效酶S66A β3GalT5-1变体的开发。从Sf9细胞表达和纯化的新开发糖型S66A β3GalT5-1在GH系列糖类生产方面显示出比LgtD高10倍的效率。在一项独特的方法中，Ghosh等人通过稳定的肟连接将Globo H六糖与两性离子多糖PS-A1偶联。在健康C57BL/6小鼠中与佐剂一起测试时，"完全基于碳水化合物"的缀合物引发稳健的抗原特异性免疫应答，表现为高滴度的高度特异性IgG和IgM抗体。这些抗体能够结合培养中的Globo H阳性癌细胞（MCF-7和OVCAR-3）并成功介导补体依赖性细胞毒性。
靶向Globo H的疫苗，如Adagloxad Simolenin（OBI-822），将Globo H六糖与KLH偶联以诱导针对表达Globo H肿瘤的免疫应答。在转移性乳腺癌（MBC）患者中进行的一项安慰剂对照II期研究（NCT01516307）揭示了体液免疫应答与临床结果之间的强相关性。这一发现在该领域具有关键意义，因为它表明疫苗的疗效取决于患者免疫应答的质量，为个性化临床设计开辟了道路。向前推进，Globo系列疫苗与皂苷基佐剂一起已在更明确的人群如早期疾病患者中评估安全性和有效性。该制剂（OBI-822）随后被推进至III期临床试验GLORIA，用于高危三阴性乳腺癌（TNBC）患者的辅助治疗。与II期研究不同，GLORIA试验整合了强制性IHC筛查以选择具有适当Globo H表达水平的患者。最近，Ma等人报道化学酶法衍生的Globo H-CRM197缀合物与佐剂QS-21和3D-MP的组合引发稳健的免疫应答。在该报告中，作者讨论了Globo H抗原的简化化学酶法合成及其与载体蛋白CRM197（白喉毒素的无毒形式）的偶联。此外，该研究讨论了3-O-脱酰基单磷酰脂质A（3D-MPL）作为佐剂的有效合成。Globo H-CRM197与不同佐剂如QS-21、3D-MPL或S34（单独或组合）的制剂在Balb/c小鼠中显示抗体应答和Th1细胞免疫，其中3D-MPL和S34的组合显示最强应答。从免疫小鼠提取的IgG抗体对Globo H阳性细胞显示特异性结合亲和力，以及增强的补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬活性。尽管在体外显示强抗肿瘤活性，但疫苗接种在4T1荷瘤Balb/c小鼠中未引发抗肿瘤活性。该领域的进展随时间相当迅速，迄今开发的不同疫苗类别总结于Fig. 4。Globo H基疫苗最显著的例子总结于Table 1。今年早些时候，关键性GLORIA研究（NCT03562637）因安全性问题和不太可能达到其主要疗效终点而终止。这一终止促使资源立即重新分配，以及行业总体转向替代技术如ADCs和双特异性抗体。靶向Globo H的抗体和CAR T细胞的开发也在进行中，扩展了定向肿瘤免疫治疗的领域。
**糖蛋白上的TACAs——Lewis抗原**
Lewis抗原是一个碳水化合物结构家族，包括Lewisx（Lex）、Lewisy（Ley）、唾液酸化-Lewisa（sLea）和唾液酸化-Lewisx（sLex），其表达在胚胎发育期间至关重要，在成人组织中显著降低。癌细胞在其糖萼中显示这些抗原的异常上调表达，已被发现参与肿瘤进展、转移和免疫逃逸。唾液酸化-Lewisa和唾液酸化-Lewisx对E-选择素、P-选择素和L-选择素（表达于内皮细胞和白细胞上的粘附分子）显示强结合亲和力。凭借Lewis抗原的过表达，肿瘤细胞利用E-选择素介导的与血管内皮的粘附，使其能够停滞在远处器官并外渗进入组织，促进转移扩散。
由于其癌症相关表达，Lewis抗原是免疫治疗方法的有吸引力的靶点，包括疫苗、单克隆抗体和糖工程CAR T细胞。少数基于Lewis抗原的肿瘤疫苗已进入临床试验并正在不断改进。由于相对较小，Lewis抗原被认为是弱免疫原，因为它们通常可能无法诱导稳健的适应性免疫应答，除非与载体蛋白偶联。为增强其免疫原性，研究人员将Lewis抗原与载体蛋白如匙孔血蓝蛋白（KLH）或白喉类毒素（CRM197）偶联，并观察到稳健免疫应答的刺激，特别是在Balb/c小鼠模型中。免疫后非荷瘤小鼠的血清学分析是这些报告中抗体滴度评估的主要方法。然而，Kawamura等人的报告还显示，一旦小鼠免疫SSEA1-CRM-197缀合物，随后移植iPSC-CMs（诱导多能干细胞衍生心肌细胞）导致 engraftment 而无否则观察到的肿瘤形成。Lewis抗原sLea在与KLH偶联并与佐剂如GPI-0100或QS-21一起施用于非荷瘤C57BL/6小鼠模型时也显示引发高IgG滴度。产生的IgG和IgM抗体显示特异性识别sLea阳性癌细胞（SW626细胞系）并在体外诱导补体依赖性细胞毒性（CDC），确立了载体蛋白和佐剂在引发有效免疫应答中的重要作用。Diab等人证明sLea-KLH疫苗与免疫佐剂QS-21一起，在患者皮下注射后能够产生针对sLea的强抗体应答。有趣的是，从接受sLea-KLH疫苗的患者血清中分离出一种对sLea高度特异性和强结合的抗体，命名为MVT-5873。这种由Gupta等人开发的独特糖诱导免疫治疗显示出巨大前景，并已进入胰腺癌临床试验。该抗体对sLea抗原显示精致特异性，与其他相关抗原如Lea、sLex或Ley无交叉反应。这些临床试验目前正在进行中，患者为转移性胰腺癌且血液中碳水化合物抗原19-9（CA 19-9）水平升高。后续研究表明，从免疫sLea-KLH疫苗的人患者衍生的抗体在临床前研究中并不令人印象深刻。为进一步实现增强的治疗效果，抗体的Fc部分被重新改造。
过去五年见证了基于Lewis抗原的糖缀合物的合成策略以及糖缀合物疫苗平台/载体系统创新的并行进展。Guo及其同事的近期研究强调了用于合成复杂Lewis抗原的一锅预激活和迭代糖基化的有效性。该方法涉及硫糖苷供体的顺序激活，导致六糖和九糖核心的快速构建，无需在每个中间步骤纯化。该研究还强调了使用特定保护基如葡萄糖胺的N-邻苯二甲酰亚胺基和半乳糖的苄基或苯甲酰基对于维持β?1→4和α?1→2连接的区域特异性和立体选择性很重要。在更新的合成策略中，科学家使用Umemoto试剂和Cu(OTf)2在紫外照射下合成需要空间位阻受体糖基化的复杂KH-1抗原。
关于抗原呈递形式以有效诱导向高亲和力IgG抗体类别转换的近期进展，通过乳糖间隔臂与KLH连接的合成Lewis抗原（Lex、Ley、KH-1）已被证明是富含Lex/Ley肿瘤细胞的有效免疫致敏剂。已进行高通量研究以建立各种Lewis抗原的比较结构-免疫原性关系。这项研究的一个关键见解是，合成糖缀合物中抗原的天然空间呈递可能与肿瘤细胞表面的不同。因此，连接子长度和密度需要仔细优化以匹配天然肿瘤糖萼。这项研究还导致了增强Lewis抗原免疫原性的最具影响力策略之一的发展，即碳水化合物结构的氟化。它导致产生"非己"模拟物，可以打破中枢耐受（激发免疫应答），同时仍保持与天然抗原交叉反应所需的构象完整性。
与传统的基于蛋白质的载体相反，Rashidijahanabad等人制备了唾液酸化Lewisa（sLea）功能化的噬菌体Qβ缀合物，并观察到强而稳健的抗sLea IgG抗体应答。该研究描述了合成sLea四糖抗原的立体选择性合成路线，随后偶联到噬菌体Qβ颗粒上以产生稳定的Qβ-sLea缀合物。在C57BL/6小鼠中免疫后，Qβ-sLea缀合物诱导强而持久的抗sLea IgG抗体，水平比KLH-sLea疫苗高几个数量级。作者证明提取的抗sLea抗体对工程化小鼠导管腺癌细胞（FC1199FB）上表达的sLea表位高度选择性，并通过补体介导的细胞毒性诱导凋亡。免疫Qβ-sLea缀合物的小鼠在攻击sLea阳性肿瘤细胞后显示高抗sLea IgG滴度，并在转移性小鼠黑色素瘤模型中显著减少肿瘤发展。显而易见，基于Lewis抗原的肿瘤免疫治疗靶向领域已从基础筛选和鉴定显著进展到多样化的治疗策略（Fig. 5）。有希望的是，正在进行的研究侧重于优化每种方法以实现临床转化（Table 1）。
**截短型黏蛋白型O-聚糖**
这组糖类代表细胞糖组的"过度简化"，即它们是癌细胞特有的O-糖基化途径的"起点"。致癌转化不是形成长的健康糖链，而是导致截短糖链的形成，产生三种特定结构：Thomsen-nouveau（Tn）、唾液酸化-Thomsen-nouveau（sTn）和Thomsen-Friedenreich（TF）。这些统称为"黏蛋白型"O-聚糖，因为它们最初被发现且最丰富于一种称为黏蛋白的糖蛋白上。术语"黏蛋白型糖基化"指的是GalNAc连接至丝氨酸或苏氨酸氨基酸氧原子的过程。这种GalNAc连接是黏蛋白如何构建的"签名"，任何以这种方式开始的糖链都被归类为"黏蛋白型"，即使它发现于非黏蛋白蛋白质上。黏蛋白是高度糖基化的高分子量蛋白质，主要表达于上皮细胞的顶端表面。其主要功能是通过维持黏膜屏障完整性和水合来保护和润滑黏膜组织。黏蛋白糖蛋白家族约有20个成员，每个形成丝状"刷状"结构，其刷毛上带有数百条糖链。癌症中常观察到的一个标志是细胞表面存在异常糖基化的黏蛋白。例如，MUC1在许多癌中过表达和低糖基化。这种糖蛋白极化分布的丧失导致许多TACAs暴露，如Tn、唾液酸化-Tn（STn）和唾液酸化-Lewisa/x（sLea/sLex）。黏蛋白的这些独特特征吸引了研究人员多年来开发癌症疫苗。
针对MUC相关TACAs疫苗开发的早期尝试之一是G. F. Springer的开创性工作，他证明乳腺癌患者中的Thomsen-Friedenreich（TF）抗原引发细胞介导的免疫应答。这些免疫应答对患有乳腺癌的女性特异，在健康个体中很少具有免疫原性。基于这些研究，研究人员进一步开发了基于TF（Galβ1?3GalNAc?α?O?Ser/Thr）和Tn（GalNAc?α?O?Ser/Thr）抗原的诊断和免疫治疗策略。进一步，Springer及其同事开发了第一批靶向Tn抗原的鼠抗体，后来Hakomori开发了针对sTn的单克隆抗体（mAb）。随后，发现了许多针对MUC相关抗原的其他抗体，然而，这一代抗体缺乏特异性。近几十年来，研究人员对开发基于MUC抗原的疫苗给予了极大关注。一个这样的例子是Theratope或sTn-匙孔血蓝蛋白缀合物疫苗，它经历了乳腺癌临床试验但表现出有限疗效。这一挫折归因于患者选择肿瘤sTn表达较低。进一步的研究包括使用肽开发疫苗。例如，MUC1脂肽疫苗L-BLP25在NSCLC的II期试验中显示出优异结果，尽管III期试验未确立更广泛的意义。早期疫苗开发的有限结果揭示了TACAs和肿瘤微环境的复杂性，并推动了向定制免疫治疗的转变。MUC抗原偶联疫苗开发的最新改进包括MUC1肽骨架、T辅助表位和与TACAs的强效佐剂。如Fig. 6所总结，研究人员通过纳入脂质体、病毒样颗粒和金纳米颗粒一直在持续改进疫苗候选物。目标一直是实现完整黏蛋白抗原的稳定运输和改善抗原呈递，从而确保强免疫治疗结果同时避免非特异性免疫激发。在过去三年中，已报道了增强黏蛋白靶向肿瘤免疫治疗的杰出进展，这里强调一些相关进展。
为克服对内源性糖苷酶的易感性，Wu等人报道了一种非天然结构修饰的β-连接MUC1 TF缀合物的合成和免疫学评价。通过策略性改变糖苷键的拓扑结构，作者设计了一种糖肽模拟物，其表现出改善的抗酶切割抗性，同时仍保持免疫识别所需的精确分子呈递。在一项独特的方法中，Pifferi等人通过由肿瘤特异性MUC1抗原、皂苷基免疫刺激分子和辅助T细胞肽组成的合成三组分疫苗在小鼠模型中显示出强免疫原性应答。作者将合成MUC1糖肽偶联至皂苷支架，随后使用正交化学连接将PV辅助T细胞表位肽附着。进一步，该研究描述了三组分缀合物在水溶液中自组装，在其表面暴露MUC1抗原。在雌性C57BL/6小鼠中注射三组分疫苗后，观察到强而持久的抗原特异性抗体应答（特别是IgG1和IgG2b）。三组分疫苗接种小鼠的血清特异性识别MCF-7细胞上的TA-MUC1，NMR研究表明三组分疫苗与二组分对照相比的优越免疫原性应答与三组分疫苗的聚集行为和稳定性相关。这项研究引人入胜的部分是在不需要外部佐剂或载体蛋白的情况下诱导三组分疫苗的稳健免疫原性应答。Murphy及其同事制备了含有合成S-GalNAc糖簇的MUC1 Tn功能化糖肽，并研究了其免疫调节功能。作者首先合成了将三个α-S-GalNAc残基嫁接到含有氨基酸连接子（TPEaa）的四苯乙烯（TPE）支架上的糖簇，然后制备了几个有或没有T辅助表位P30的MUC1糖肽片段。糖簇后来被制成模块化疫苗构建体，纳入MUC1 Tn糖肽和P30 T辅助表位。将MUC1 Tn制备的糖肽暴露于DCs显示通过MGL受体增强的受体介导摄取。用MUC1 Tn制备的糖肽疫苗接种后，C57BL/6J小鼠（成年雌性）产生针对MUC1 Tn的特异性抗体。作者得出结论，携带GalNAc糖簇的MUC1 Tn制备的糖肽疫苗引发高滴度抗Tn-MUC1抗体而不会导致对靶抗原选择性的丧失。
最近，Jayaraman及其同事证明Tn抗原糖脂和BSA的复合形成稳定胶束，在淋巴结中诱导体液应答以产生针对Tn抗原的特异性抗体。作者通过将异头α-丝氨酸偶联至PEG连接的磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）合成Tn抗原糖脂。该研究讨论了糖脂在PBS中的胶束化和在BSA存在下的解胶束化以形成糖脂-BSA胶束。发现Tn-糖脂-BSA复合物"搭便车"至淋巴结并导致强免疫应答。与Tn和BSA的共价缀合复合物相比，它可以在Balb/c小鼠模型中诱导约8-10倍高的抗体滴度。Zhou等人报道了自佐剂多价MUC1糖肽疫苗，在没有外部佐剂的情况下引发稳健的抗肿瘤免疫应答。最初，制备了在T9、S15和T16处糖基化有Tn抗原的MUC1串联重复肽。随后，MUC1糖肽与T辅助细胞表位P30肽和Pam3CSK4（一种TLR-2配体的脂肽）偶联以生成单价和三价自佐剂疫苗。当多价糖肽疫苗注射到野生型和MUC1转基因小鼠中时，野生型小鼠产生显著更高滴度的MUC1特异性抗体，属于IgG1、IgG2b和IgG3亚型，暗示有效的体液免疫应答。当接种疫苗的小鼠用B16-MUC1肿瘤细胞攻击时，它们显示延迟的肿瘤发展和延长的生存期，特别是接受三价疫苗的那些。这些发现表明自佐剂多组分MUC1疫苗具有临床使用潜力。该研究组进一步推进了该领域，最近开发了一种Tn-DSPE-PEG-2000两亲性疫苗，能够实现Tn抗原的内吞递送以改善免疫呈递。以非常有创意的方式，他们还使用第一、第二和第三代聚（醚亚胺）（PETIM）树枝状聚合物合成了多价Tn表位。在展示价数依赖性免疫应答的同时，该研究传达增加合成支架上的抗原密度可以克服TACAs的低免疫原性。
Nishat等人报道了一种新的糖肽基疫苗Tn-PV-PS A1，诱导Tn特异性细胞毒性T淋巴细胞。他们描述了Tn功能化糖肽衍生物Tn-PV-ONH?的合成，然后使用肟化学选择性连接到氧化的两性离子多糖载体PS A1上以产生Tn-PV-PS A1疫苗。实验数据显示，与未缀合的Tn-PV肽相比，Tn-PV-PS A1诱导强T细胞增殖。此外，从用Tn-PV-PS A1处理的C57BL/6小鼠中分离的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞显示对Tn-PV肽的强亲和力。最后，研究表明分离的CD8+ T细胞分泌大量干扰素γ，并特异性识别表达Tn MUC1抗原的鼠EL4肿瘤细胞并诱导凋亡。作者得出结论，大两性离子PS A1载体可能促进了MHC-1交叉呈递，这是基于碳水化合物的载体不寻常的特征。Weng等人使用化学酶法合成构建了唾液酸化-Thomsen–Friedenreich（sTF）抗原，随后与CRM197偶联以产生sTF-CRM197疫苗。用sTF-CRM197缀合物（有或没有KRN7000）免疫Balb/c小鼠产生显著量的特异性IgG抗体。进一步，该研究描述sTF-CRM197疫苗诱导的抗血清对表达sTF抗原的T-47D乳腺癌细胞显示特异性亲和力，并在体外通过补体依赖性细胞毒性诱导细胞杀伤。免疫小鼠被研究42天，其中注意到IgG滴度增加以IgG1为主和IgM滴度降低，暗示类别转换和长期二次免疫应答的建立。
Bermejo等人证明了具有非经典氨基酸的MUC1糖肽制备在金纳米颗粒上在Balb/c小鼠中引发的有效免疫应答。该研究展示了通过用非经典氨基酸替换免疫优势APDTRP表位处的苏氨酸残基来合成有或没有α-O-GalNAc的MUC1肽。结合研究表明，含有非经典氨基酸（2S,3R）-3-羟基正缬氨酸1-Hnv*的合成MUC1糖肽与天然对应物1-Thr*相比显示相似或更高的对抗MUC1抗体的结合亲和力。构象和抗体-抗原复合化研究表明，含Hnv的糖肽模拟天然对应物1-Thr*，具有增加的CH/π相互作用，导致强而稳定的结合。进一步，糖肽1-Hnv*被固定在金纳米颗粒上以评估非荷瘤Balb/c小鼠中的免疫应答。免疫后，产生的抗MUC1 IgG抗体特异性结合MUC1阳性乳腺癌T47D细胞而非MUC1阴性HEK293T细胞。这种方法通过纳入非经典氨基酸，随后进行构象优化和抗体-抗原复合物分析，有助于开发下一代抗癌糖疫苗。在另一项研究中，作者报道了工程化糖肽纳米颗粒作为诊断工具检测循环肿瘤相关自身抗体对抗MUC1，通常在胰腺癌患者血清中发现。在展示GST*A表位的糖肽中，携带N-丙酰化Tn糖肽的纳米颗粒探针成为筛选胰腺癌患者血清的最有效探针，具有85%灵敏度和90%特异性，优于当前临床生物标志物CA19-9和癌胚抗原（CEA）。
Liao及其同事报道了由Thomsen-Friedenreich（TF）抗原、iNKT细胞激动剂和Mincle配体组成的三组分糖疫苗的合成，并研究了其在Balb/c小鼠模型中的免疫调节应答。该研究描述了TF糖肽片段、iNKT细胞激动剂KRN7000衍生物和Mincle激动剂vizantin衍生物的合成。这些片段后来利用酰胺连接和点击化学组装以构建三组分糖缀合物，例如KRN7000-TF-vizantin，二组分糖缀合物如TF-KRN7000和TF-vizantin。在这些疫苗候选物中，与TF-KLH/明矾和相应的二组分缀合物疫苗相比，KRN7000-TF-vizantin引发TF特异性IgG和IgM抗体的稳健产生。进一步，抗体同种型和分泌细胞因子的分析揭示KRN7000-TF-vizantin诱导Th1和Th2免疫应答，其中Th1更突出。此外，KRN7000-TF-vizantin对CD1d和Mincle受体均显示强结合亲和力，暗示iNKT和Mincle信号途径的激活。接种疫苗小鼠的抗血清对TF阳性癌细胞显示特异性亲和力以及补体依赖性细胞毒性（CDC）。使用鼠乳腺癌细胞（TA3Ha）的肿瘤攻击研究表明，用KRN7000-TF-vizantin免疫的小鼠表现出改善的耐受性和对肿瘤再攻击的保护，无需进一步治疗。为进一步探索结构-免疫原性关系，作者构建了使用Mincle激动剂既作为载体又作为自佐剂的Tn功能化糖缀合物。该研究包括使用化学选择性和正交反应的广泛化学操作，以改变Mincle激动剂海藻糖基骨架上的Tn抗原和脂质的位置和数量。免疫学研究揭示，虽然所有缀合物均引发免疫应答，但含有两个通过芳基连接子与脂质链连接到海藻糖的Tn抗原的缀合物显示最高免疫原性应答。它显示稳健的IgG抗体产生，促进Th1/Th2细胞因子释放，并对人Mincle-Fc蛋白显示特异性亲和力。从免疫小鼠提取的血清对T阳性癌细胞系显示特异性结合以及增强的CDC活性。缀合物与EcMPLA（TLR4激动剂）和氢氧化铝（Al）共同给药进一步增强其免疫原性效力，并通过抑制肿瘤生长延长小鼠生存期。此外，用肿瘤细胞再攻击存活小鼠时，即使没有额外治疗也未观察到肿瘤生长。
在最近的一份报告中，Zong及其同事报道了具有不同糖型的糖肽-蛋白质缀合物疫苗，并研究了其在Balb/c小鼠模型中的抗肿瘤免疫。该研究描述了使用化学酶法液相合成策略合成具有不同糖型（包括Tn、T、STn和α2,3-ST抗原）的21聚体MUC1糖肽的四种变体。糖肽随后与CRM197载体蛋白偶联以产生糖肽-蛋白质缀合物疫苗。用MUC1-糖肽-CRM197缀合物与各种佐剂组合接种小鼠后，观察到特异性抗体产生。有趣的是，QS21+MPL的组合被确定为有效佐剂。进一步实验表明，所有糖基化MUC1疫苗制剂对表达MUC1的MCF-7癌细胞显示强亲和力，并在体外诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性巨噬细胞吞噬活性（ADCP）。此外，该研究证明接种疫苗小鼠的血清特异性结合人乳腺癌细胞。与此同时，Pesce等人构建了用黏蛋白-1 Tn和sTn模拟抗原制备的GMMA囊泡，并评估了其在Balb/c小鼠三阴性乳腺癌模型中的免疫原性应答。Tn（GalNAc-α-O-Ser/Thr）和sTn（唾液酸-GalNAc-α-O-Ser/Thr）模拟物通过结构锁定类似物合成，然后偶联到从革兰氏阴性菌纯化的基因修饰外膜囊泡（GMMA）以产生GMMA-Tn和GMMA-sTn糖缀合物。当GMMA-Tn和GMMA-sTn制剂暴露于CD-1和Balb/c小鼠时，检测到抗原特异性抗体的显著产生，如IgG1、IgG2a和IgG2b亚类。Pifferi等人进一步推进了他们的策略，使用嫁接到CRM197载体蛋白上的环肽支架制备了成簇四价缀合物。该研究揭示了支架介导的抗原展示对于改善表位识别和整体疫苗效力的重要性。
糖缀合物领域中另一个感兴趣的受体是分化簇44（CD44），其在癌细胞表面异常糖基化以及失调。CD44是一种跨膜糖蛋白，由于显著的结构异质性而表现出高度可变的分子量（约80至200 kDa）。结构异质性主要源于其基因的可变剪接和翻译后修饰（PTMs）。糖基化作为最突出的PTM，进一步放大了结构变异性，其中高度糖基化的CD44分子量可高达200 kDa。CD44表达于一系列正常细胞，通过其与细胞外基质的相互作用参与细胞-细胞相互作用、粘附和迁移。CD44表达在许多类型的癌症中失调，包括乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和肺癌。CD44在癌症中的失调主要不同于其过表达、改变的亚型表达和异常糖基化。此外，CD44具有癌症干细胞特征，也被称为"干性"标志物，与肿瘤起始、进展、转移和治疗耐药性相关。这些独特特征使CD44成为肿瘤免疫治疗的有吸引力的靶点。
我们描绘了基于糖缀合物靶向CD44的两种不同方法。一方面，其作为几种TACAs如Tn、sTn、sLex和sLea的主要支架的存在用于设计基于TACA模拟物的疫苗。另一方面，其在肿瘤细胞表面的过表达用于设计直接结合介导的免疫治疗剂。使用前一种方法开发的糖缀合物在本节中总结，而使用后一种方法利用其直接结合剂即透明质酸的糖缀合物在其下一节中获得应有的讨论。随着通过使用合成糖肽的抗体生成技术的并行进步，靶向CD44的抗体的开发再次兴起。Aasted等人设计了一种单克隆抗体4C8，其对CD44v6亚型的Tn糖基化表位具有选择性。作者使用基于Fmoc的固相肽合成策略中的糖基化氨基酸合成糖肽[GYRQTPKEDSHS(Tn)TTGTAAA]。用该糖肽的KLH缀合物免疫Balb/c小鼠，随后基于杂交瘤的筛选导致分离出4C8，该抗体被提议作为糖疫苗候选物。作者进一步工程化该抗体以构建独特的CAR-T细胞，其对Tn+肿瘤细胞显示广泛识别，而不仅对表达CD44v6的肿瘤。该研究强调了糖肽在肿瘤免疫治疗领域的深远潜力。
在Freitas等人报道的一种非常新颖的方法中，报道了靶向CD44s-Tn抗原阳性癌症的糖疫苗的制剂。首先，作者通过使用GalNAc转移酶糖基化CD44s的30聚体片段开发了一种糖肽。随后，它被ST6GalNAc-I酶唾液酸化以实现完整抗原结构。结构分析揭示糖肽含有Tn和sTn的混合物，其模拟特定类型癌细胞上的异质性。在制备CD44-sTn糖肽后，将其与单核细胞衍生的树突状细胞混合以评估C57BL/6小鼠中的免疫应答。令人惊讶的是，CD44-sTn糖肽诱导对树突状细胞的显著毒性，阻碍了这些糖肽作为疫苗的直接使用。为缓解这一问题，糖肽与免疫刺激性载体蛋白如CRM197和KLH偶联。CD44-sTn KLH缀合物仅在用MPLA（佐剂）刺激时显示增强的免疫应答。用KLH-CD44-sTn和MPLA免疫的小鼠引发抗原特异性IgG和IgM抗体，其对CD44-sTn糖肽和CD44-sTn癌细胞显示特异性亲和力。此外，提取的抗体对表达CD44-sTn抗原的癌细胞显示补体依赖性细胞毒性（CDC）。该研究展示了癌症糖疫苗的有希望原型，从而为肿瘤免疫治疗中的未来精准医学开辟了途径。
对糖脂和糖蛋白这两类之间免疫应答的仔细观察揭示了值得注意的趋势。虽然神经节苷脂等糖脂的模拟物刺激NK细胞和先天途径，但基于糖蛋白如黏蛋白型-O-聚糖的缀合物通过唤起树突状细胞介导的免疫应答起作用。在Globo-H的情况下，文献反映了从天然六糖的弱"自身耐受"应答向完全合成多糖与KLH等载体偶联并与QS-21等强佐剂偶联时强T细胞依赖性应答的转变。不同基于TACA的糖缀合物免疫应答性质的差异导致其抗肿瘤益处的不同种类。具体而言，基于MUC1的缀合物导致实体瘤的裂解，Globo-H缀合物诱导补体介导的肿瘤细胞杀伤，而GM2（神经节苷脂）缀合物导致微转移的预防。在过去20年糖生物学中确定的最重要趋势是"信号2"的需求。在大多数情况下，单独的TACA仅添加信号1并导致B细胞耗竭或短暂IgM。TACA+载体+佐剂添加信号2并产生生发中心应答，这已被利用来实现抗肿瘤"记忆"，从而产生"疫苗样"效应。
**非TACA基糖缀合物——单糖作为靶向工具**
**葡萄糖**
葡萄糖是几乎所有哺乳动物细胞代谢能量和大分子生物合成的重要组分。葡萄糖本质上是亲水性的，依赖转运蛋白如钠-葡萄糖协同转运蛋白（SGLTs）和葡萄糖转运体（GLUTs）通过疏水性质膜摄取。GLUT家族蛋白由SLC2A基因编码，表达于各种组织，在真核细胞跨细胞膜转运单糖中发挥重要作用。葡萄糖通过选择性和可逆机制与GLUT转运体结合，特别是GLUT1和GLUT3。其跨膜结构域中的特定氨基酸残基允许GLUT1和3在外向和内朝向构象之间交替，从而调节葡萄糖转运。GLUT1对葡萄糖的相当高结合亲和力（由显著小的结合常数即Km ~ 1–3 mM表示）确保即使在低葡萄糖条件下也能有效摄取葡萄糖。GLUT1和GLUT3受体的表达在许多肿瘤中显著上调，如肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤。肿瘤细胞利用这些受体满足其源自快速增殖细胞的高代谢需求。GLUT1作为Warburg效应的关键介质，即肿瘤细胞从糖酵解中掠夺能量的能力。通过GLUT1的转运确保连续葡萄糖流入以燃料糖酵解、核苷酸生物合成和脂质代谢。这种葡萄糖依赖性的独特特征导致了强大肿瘤诊断平台的开发，即[18]F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）成像。GLUT家族受体特别是GLUT1和GLUT3的过表达与侵袭性、转移和总体较差生存率相关。
许多致癌途径如HIF-1α、c-Myc和PI3K/Akt信号已知促进GLUT1过表达。由于其癌症特异性过表达，GLUT1被认为是抗癌治疗中的治疗靶点。开发靶向GLUT转运体用于癌症治疗的糖缀合物和葡萄糖功能化前药的兴趣日益增长。葡萄糖功能化纳米颗粒也已被研究作为增强葡萄糖呈递以与癌细胞上过表达GLUT1转运体有效相互作用的手段。在最近的一篇综述中，Seeberger、Yin及其同事很好地总结了利用癌细胞中葡萄糖转运体如GLUT1过表达进行靶向药物递送的糖缀合物的开发。虽然许多抗肿瘤药物如5FU、奥沙利铂、紫杉醇和阿霉素已被报道通过GLUT1靶向递送，但没有报道GLUT1靶向糖缀合物完全通过引发免疫系统发挥抗肿瘤效应。此外，T细胞也依赖GLUT受体，特别是GLUT1，来驱动克隆扩增和效应功能。TME内这种共享的葡萄糖依赖性助长了敌对的代谢竞争，导致肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的葡萄糖剥夺，最终导致T细胞功能障碍和免疫逃逸。GLUT1表达最近被报道影响TME中的免疫细胞浸润。通过GLUT1抑制和CAR T细胞激活的免疫致敏报告已开始出现。然而，这些方法大多涉及GLUT1表达或功能的遗传或药理学调节，而不使用糖缀合物。需要进一步研究探索此类GLUT1靶向缀合物的潜在免疫调节效应。
基于葡萄糖的糖缀合物的一个引人入胜的应用是在光动力疗法（PDT）领域。一方面，糖衍生化有助于通过过表达的GLUT受体将PDT剂靶向癌细胞。另一方面，一些独特的PDT剂还诱导免疫原性细胞死亡（ICD），一种程序性细胞死亡形式，提醒免疫系统肿瘤细胞的存在。ICD涉及钙网蛋白易位至细胞表面以及高迁移率族蛋白1（HMGB1）和ATP释放到细胞外基质中。这两者均作为损伤相关分子模式（DAMPs），即树突状细胞（DCs）的有效招募和激活信号。这导致DCs的有效" priming"以产生强适应性免疫应答。其中一些独特缀合物过去被开发为"第三代PDT剂"。例如，葡萄糖偶联的（四氟苯基）二氢卟吩，或G-chlorin，与第二代PDT剂他拉泊芬钠相比显示细胞毒性增加20-50倍，同时诱导免疫原性细胞死亡（ICD）并靶向肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。另一类葡萄糖导向免疫调节剂是"用于检查点阻断的糖基化抗体"。这些特别是在胶质母细胞瘤背景下开发的，其中血脑屏障上GLUT1的表达被用于促进抗PD1抗体向肿瘤的转胞吞作用。使用"糖基化多聚PEG化"策略功能化检查点阻断抗体。使用还原敏感性连接子连接PEG链，以便在GBM微环境中发现的高谷胱甘肽水平存在下释放游离功能性抗体。葡萄糖偶联也被用于TLR7激动剂咪喹莫特（IMQ）的精确空间递送。还开发了一种组合纳米疗法，将阿霉素和IMQ包封在胶束系统中，胶束表面用葡萄糖配体装饰。在酸性TME中，这些胶束被显示暴露葡萄糖配体并导致DOX和IMQ在癌细胞和TAMs（两者均过表达GLUT1受体）中的积累增加。结果是癌细胞的凋亡和ICD以及TAMs的M2向M1极化，即以DCs和细胞毒性T细胞形式表现的持续抗肿瘤免疫应答。
在最近一份引人入胜的报告中，Pu等人配制了2-脱氧葡萄糖（2-DG）和铁酸铋共载凝胶（DBG），并展示了癌症压电催化免疫治疗。该研究描述了2D BiFeO3纳米片的合成，然后用2-脱氧葡萄糖包封在ROS敏感性水凝胶中，该水凝胶通过将聚（乙烯醇）（PVA）与ROS不稳定性N1-(4-硼苄基)-N3-(4-硼苯基)-N1,N1,N3,N3-四甲基丙烷-1,3-二胺（TSPBA）连接子结合而开发。在肿瘤中植入DBG凝胶后，超声波诱导局部ROS产生并产生压电信号，促进抗癌免疫的刺激。已知高水平N-聚糖会阻碍TME中的免疫应答，然而在这种情况下，超声介导释放的2-脱氧葡萄糖抑制N-糖基化，协同克服肿瘤的免疫抑制微环境。这项研究的有趣特征是DBG和超声的纳米催化免疫治疗技术不仅抑制肿瘤生长，还产生强免疫记忆。Table 1将这项研究列为GLUT1靶向肿瘤免疫治疗的值得注意的候选物。
与改善抗癌免疫记忆一致，葡萄糖功能化纳米疫苗被开发用于重编程DCs，DCs是适应性免疫应答的主要协调者。作者确认GLUT1是向DCs递送抗原的可靠靶点，因为GLUT1在不同种类DCs上过表达，且葡萄糖消耗对DC存活和激活至关重要。载有卵清蛋白（OVA）的糖基化纳米疫苗显示能够触发更强免疫应答并显示比传统非糖基化纳米疫苗更高的抗肿瘤疗效。这归因于葡萄糖配体与DCs表面GLUT1的特异性结合，满足DC激活的高葡萄糖需求，同时促进肿瘤相关抗原（卵清蛋白）在其MHC上的呈递。使用基于葡萄糖的缀合物的有希望免疫治疗候选物总结于Fig. 7。尽管有希望，GLUT靶向糖缀合物从临床前成功向临床适用性的转变是一段复杂的旅程。GLUT1在脑和红细胞等必需组织中的存在需要高度精确性。这组免疫调节剂最有希望的方向是与其他靶向方式整合以增强特异性。利用GLUT（代谢标志物）和CD44（表面抗原）存在的双靶向系统正在开发中。此外，使用具有更有限表达模式的III类转运体如GLUT8将为糖缀合物的运输提供系统更安全的途径。
**半乳糖**
半乳糖凝集素靶向策略在肿瘤免疫治疗中的潜力源于这些凝集素在肿瘤微环境中发挥的关键作用。半乳糖凝集素是一个可溶性β-半乳糖苷结合蛋白家族，通常与细胞表面糖缀合物相互作用。半乳糖凝集素家族成员在不同类型组织中显示优先分布。成员如Gal-2、Gal-4和Gal-7专门表达于身体的保护屏障即肠道内衬和皮肤，在那里它们管理上皮细胞更新和防御病原体。成员如Gal-1和Gal-3在相对更广泛的组织类型中表达，但它们优先在血管系统和免疫细胞中增强以控制细胞迁移、血管生成和免疫耐受。虽然半乳糖凝集素表达在正常组织中显示特定模式，但其异常上调和细胞外分泌始终与肿瘤免疫逃逸和不良临床结果相关。在恶性肿瘤中，它们充当细胞外免疫检查点，通过抑制浸润T细胞促进肿瘤进展、细胞-细胞相互作用和免疫逃逸。
在15种已知哺乳动物半乳糖凝集素中，半乳糖凝集素-1（Gal-1）和半乳糖凝集素-3（Gal-3）研究最广泛。Gal-1参与免疫抑制，通过诱导活化T细胞凋亡促进肿瘤免疫逃逸。Gal-3以其在癌症进展中的作用而闻名，通过与整合素和细胞外基质（ECM）组分相互作用增强肿瘤细胞存活、血管生成和转移。因此，半乳糖凝集素通过调节肿瘤微环境促进肿瘤生长。虽然它们促进免疫逃逸，但也通过与MUC1等糖蛋白相互作用增强癌细胞迁移。此外，半乳糖凝集素介导凋亡抗性并参与几种恶性肿瘤的化疗耐药性。由于其多方面的致癌进展作用，已做出许多努力通过开发小分子、缀合物和大分子组装体靶向半乳糖凝集素以引发癌症中的免疫调节应答，使用半乳糖作为靶向糖的最显著者总结于Fig. 8。
由于Gal-3的免疫抑制作用，对其抑制剂作为潜在抗癌疗法的兴趣随时间增长。这些抑制剂显示通过破坏"半乳糖凝集素晶格"和阻断TAMs上的TREM2（髓系细胞触发受体2）信号传导来规避免疫抑制效应，从而促进M1极化。在最近一篇综合综述中，作者总结了各种在临床前和临床方面显示希望的半乳糖凝集素抑制策略。一项重大成就是硫代二半乳糖（TDG）的开发，一种相比天然二糖酶抗性更强的糖衍生物。据报道，TDG通过促进免疫细胞浸润以及减少肿瘤相关血管生成来减少乳腺癌和结肠癌模型中的转移。为增强特异性和效力，研究人员合成了几种TDG的糖模拟物，其中TD139显示对Gal-3的增强结合亲和力。另一种半乳糖单糖的优秀硫代类似物是GB1107，其对Gal-3显示高亲和力和选择性。在临床前研究中，GB1107显示通过调节TME中的免疫应答（包括M2向M1表型和增强CD8+淋巴细胞浸润）来减少肿瘤生长和限制转移。尽管小分子糖模拟物作为半乳糖凝集素抑制剂领域已取得巨大进展，但在其特异性和药代动力学特征方面仍存在重要局限性，阻碍了其临床治疗批准。
半乳糖-壳聚糖纳米颗粒（GC-NPs）在增强肿瘤免疫治疗的特异性和有效性方面也显示出希望，特别是对肝癌。在一项值得注意的研究中，研究人员显示递送药物5-氟尿嘧啶或5-FU的GC-NPs能够增强NK细胞和CTLs的细胞毒性，有助于更稳健的抗肿瘤免疫应答。Hsu等人证明了半乳糖衍生纳米颗粒的开发在胶质母细胞瘤和胰腺癌中引发增强的癌症免疫原性。凝聚糖聚合物样纳米颗粒（CG NPs）通过一锅水热碳化反应聚合邻硝基苯基-β-半乳糖苷单体制备。CG NPs在表面暴露半乳糖部分，能够结合癌细胞和免疫细胞表面的半乳糖凝集素。使用C57BL/6小鼠的原位肿瘤模型，作者研究了NPs在癌细胞（GL261和Panc02）内化后的命运。CG NPs触发ROS产生并通过阻断单羧酸转运体4（MCT-4）减少乳酸外流，随后诱导细胞凋亡。在免疫细胞特别是巨噬细胞中，通过半乳糖受体介导的内吞内化后，CG NPs诱导M2向M1极化以及炎症细胞因子上调和免疫细胞激活。CG NPs和抗PD1/PDL1的联合治疗在小鼠模型中显示增强的细胞毒性T淋巴细胞激活、树突状细胞成熟和显著肿瘤缩小。AuNPs的独特光热特性允许其使用NIR照射诱导局部热疗，有效摧毁癌细胞。这些纳米颗粒可被工程化以递送免疫刺激分子或抗原，促进树突状细胞成熟和随后的细胞毒性T淋巴细胞激活。半乳糖功能化金纳米颗粒（AuNPs）递送免疫原性抗原的一个值得注意的例子是开发包含MUC1糖肽抗原和免疫佐剂α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）偶联到AuNPs的多价癌症疫苗。在这项研究中，Zhao及其同事合成了用（a）MUC1糖肽即肿瘤相关抗原，和（b）α-GalCer即恒定自然杀伤T（iNKT）细胞的有效激活剂功能化的金纳米颗粒。这些分子在AuNP表面的多价呈递被证明增强树突状细胞的抗原摄取，并在体外和体内促进稳健的免疫应答。这样的研究也为更先进的组合疗法如双光热和免疫治疗开辟了途径。在肿瘤免疫治疗领域显示希望的各种半乳糖衍生物的概述呈现于Table 1。
**甘露糖**
从先前发表的综述中可以看出，糖衍生免疫调节剂的发展很大程度上归功于对C型凝集素受体（CLRs）日益增长的认识，这是一个识别含岩藻糖和甘露糖糖类的碳水化合物结合蛋白多样性家族。该领域的增长导致了单糖作为直接抗癌剂的鉴定，以及利用含有甘露糖-6-膦酸酯（M6Pn）的糖肽配体进行靶向致病蛋白降解的溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）的开发。
甘露糖在肿瘤免疫治疗中的一个关键用途是CLR靶向免疫调节剂如甘露糖功能化纳米颗粒的形式。甘露糖功能化纳米颗粒靶向称为甘露糖受体或CD206的CLR家族成员，其存在于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和树突状细胞（DCs）上。靶向纳米颗粒通过两种机制在肿瘤微环境中引发定向抗肿瘤免疫应答，即增强吞噬作用以及激活抗原呈递机制。纳米颗粒表面的偶联糖部分促进受体介导的内吞以及调节抗肿瘤免疫应答。当甘露糖装饰在壳聚糖基纳米颗粒表面时，获得了癌症疫苗递送的潜在载体。这些纳米颗粒能够有效引发细胞和体液免疫应答以增强抗癌级联反应。科学家还探索了甘露糖功能化PLGA纳米颗粒向DCs递送抗原和siRNA，增强抗原呈递和TAMs向M1表型的重编程。一种有趣的免疫佐剂靶向胶束制剂（M-COSA）已被用于通过甘露糖定向靶向将抗原卵清蛋白（OVA）和编码CCR7的质粒DNA（CCR7 pDNA）共递送至DCs胞质。发现这些胶束促进DC向淋巴结迁移并增强MHC I限制性抗原呈递。
Pei等人的另一项研究显示由甘露糖和卵清蛋白组成的纳米颗粒引发MHC-I抗原呈递用于肿瘤免疫治疗。这些纳米颗粒通过聚乙烯亚胺（PEI）与糖蛋白缀合物的静电复合组装，其中甘露糖作为DC靶向配体，卵清蛋白作为交叉呈递抗原。当纳米颗粒暴露于树突状细胞时，通过PEI的质子海绵效应实现内体逃逸所确认的特定甘露糖受体介导摄取。进一步在胞质抗原递送后，树突状细胞成熟由共刺激标志物CD40、CD80和CD86表达增加以及炎症细胞因子产生增强所证明。交叉呈递效率最终通过将纳米颗粒处理的DCs与B3Z CD8+ T细胞杂交瘤共培养显示刺激的B3Z T细胞杂交瘤中增强的β-半乳糖苷酶活性来证明。甘露糖装饰的脂质体（M-YL/LA-Lipo）被开发并发现有效向DCs递送优势细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位肽，从而增强CTLs激活以辅助抗肿瘤免疫。脂质体表面PEG（聚乙二醇）的甘露糖修饰增强脂质体药物递送系统向TIDCs的靶向招募，证明是肿瘤精准靶向治疗的经典例子。最近，载有R848的甘露糖装饰的聚（乳酸-共-乙醇酸）即PLGA纳米颗粒（Man-pD-PLGA-NP@R848）被制备并在体内测试。R848是一种TLR7和8激动剂，显示出巨大潜力但在其递送和释放到血液中方面存在局限性。基于PLGA的纳米颗粒系统通过提供靶向机制进入并在TAMs和TIDCs中执行货物控制释放以有效肿瘤免疫治疗，遏制了R848的释放问题。
最近一个引人入胜的多价系统例子是甘露糖基化含氟多肽纳米疫苗（MFPCOFG），专门设计用于冷肿瘤。由甘露糖基化含氟聚（D,L-半胱氨酸）卵清蛋白负载Fe2+-没食子酸组成，它利用三重抗原-金属-热免疫策略的协同效应。在鼠乳腺癌模型中，NIR照射导致纳米疫苗产生强而持久的免疫应答。其主要作用机制归因于促进CD4+、CD8+ T细胞以及NK细胞的肿瘤浸润，同时平行减少Tregs和M2。作为另一个有趣的多组分系统，Song等人最近报道了一种有效的糖肽基纳米疫苗的设计和制备。他们表明使用甘露糖装饰的多肽共聚物能够靶向葡萄糖转运体和甘露糖受体，两者均在成熟DCs上过表达，导致抗原的协同递送。
最近，Jin及其同事证明给予经典甘露糖糖类诱导非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠模型中的肿瘤抑制和调节炎症微环境。用甘露糖处理的切除组织分析显示CD11b、Ly6G和F4/80表达减少，暗示髓源性抑制细胞（MDSCs）、中性粒细胞和巨噬细胞浸润减少，以及M2向M1巨噬细胞极化，同时减少小鼠血清中的炎症细胞因子。进一步分析显示甘露糖处理通过改善益生菌和抗肿瘤代谢物调节肠道微生物群。分子研究证实甘露糖处理通过靶向OGT/hnRNP R/JUN/IL-8轴抑制NSCLC小鼠模型中的肿瘤生长。甘露糖和抗PD-1的联合治疗协同增强抗肿瘤免疫并增加TME中CD8+ T细胞浸润。虽然Fig. 9总结了为CLR靶向肿瘤免疫治疗提出的现有甘露糖基策略类别，但该领域仍有多价形式更广泛研究和应用的空间。
**唾液酸**
唾液酸是一个九碳糖家族，通常是哺乳动物细胞表面大多数糖蛋白和糖脂的糖链的末端糖。唾液酸转移酶的异常上调导致超唾液酸化状态，即一个密集的、带负电荷的层，作为TACAs的物理和生化屏障，并接合广泛免疫细胞上的抑制性受体。大量研究已阐明唾液酸聚糖与这些称为Siglecs（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素）的抑制性受体相互作用的机制。该受体家族表达于NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞。Siglec-唾液酸轴允许癌细胞逃避免疫监视，类似于PD-1/PD-L1途径。因此，唾液酸衍生物正成为免疫治疗干预的有吸引力的治疗候选物。旨在阻断Siglec-唾液酸相互作用的抑制剂和抗体目前正处于临床前和临床研究中，旨在恢复免疫细胞功能并增强抗肿瘤免疫。Siglec靶向抗体-药物偶联物和CAR-T细胞也正在被探索作为根除癌症的新策略。第一代Siglec靶向糖缀合物旨在通过使用唾液酸模拟物阻断Siglec-唾液酸相互作用。研究人员还修饰了偶联到惰性支架上的唾液酸聚糖，用于对内源性唾液酸聚糖的竞争性抑制，目的是"释放"免疫细胞上的Siglecs并恢复其抗肿瘤活性。研究重点随后转向使用糖缀合物将治疗剂靶向递送至表达Siglec的细胞。这涉及使用唾液酸化糖类递送不仅药物还有免疫刺激分子。从炎症应用中汲取线索，肿瘤免疫治疗的研究人员进阶到使用唾液酸装饰的纳米颗粒/脂质体将免疫激动剂选择性递送至表达Siglec的MSDCs和TAMs，导致其重编程。依赖于免疫细胞上最普遍的靶点之一即Siglec-7、-9和-15，唾液酸功能化纳米颗粒已被用于免疫检查点抑制的拮抗剂设计。在最近的一份报告中，科学家证明唾液酸功能化脂质体能够将牛蒡子苷元特异性递送至乳腺癌细胞，导致4T1异种移植荷瘤Balb/c小鼠模型中的免疫刺激和肿瘤消退。
与此同时，糖工程技术 and 偶联化学的进步使得能够生成更复杂的具有多价和控释特性的糖缀合物。在一份非常有趣的报告中，Lustig等人显示氟化唾液酸类似物P-3Fax-Neu5Ac可作为唾液酸转移酶抑制剂（STi）以减少癌细胞上的超唾液酸化。该研究证明在用P-3Fax-Neu5Ac处理后，分别表达EGFR和HER2的MDA-MB-468和SK-BR-3细胞上唾液酸化显著减少。这些STi处理的细胞在抗EGFR和抗HER2治疗性抗体存在下表现出显著的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。当巨噬细胞上表达的抑制性受体如Siglec-7和Siglec-9被其各自抗体阻断时，观察到中等巨噬细胞依赖性吞噬作用。因此，超唾液酸化机制被抑制的癌细胞表现出增强的巨噬细胞依赖性吞噬作用和增强的治疗性抗体敏感性。报道的使用唾液酸衍生物用于肿瘤免疫治疗的关键发现被分类总结于Fig. 10。尽管该领域仍主要处于临床前阶段（Table 1），唾液酸基糖缀合物的开发代表了一种合理和靶向的方法来克服免疫抑制，并在癌症医学中具有希望。
在最近的一份报告中，Aspord及其同事探讨了黑色素瘤上存在的改变型糖类对人树突状细胞特征的影响。该研究讨论了将由BSA功能化以在黑色素瘤肿瘤中异常发现的糖类即Gal、Man、GalNAc、s-Tn、Fuc和GlcNAc基序组成的新糖蛋白（NeoGPs）暴露于人PanDCs（cDC1s、cDC2s和pDCs的混合物）。根据新糖蛋白的糖基序，在DC亚群中观察到不同的结合谱。有趣的是，岩藻糖功能化新糖蛋白直接重塑激活标志物如CD40、CD80和CD86的表达，此外它通过上调DCs中ICOS-L和PD-L1的表达重塑免疫检查点。Fuc NeoGPs还改变树突状细胞中的细胞因子/趋化因子分泌谱。此外，NeoGPs显示干扰TLR信号传导， priming DCs以在随后的TLR激活时抑制抗肿瘤细胞因子应答。此外，NeoGPs与 naive 树突状细胞上存在的C型凝集素受体如MGL和CLEC2结合。抗CLR阻断抗体显示干扰糖-CLR结合，部分恢复DC功能。该研究证明各种单糖可作为CLR/糖检查点的潜在抑制剂被利用，促进独特免疫治疗策略的开发。
**多糖——透明质酸作为靶向工具**
透明质酸（HA）或透明质聚糖是CD44最强的结合物之一，并被用作靶向实体，因为CD44在许多恶性肿瘤中过表达。这种亲和力引导的靶向策略旨在提高疗效和减少脱靶效应。CD44与透明质酸的特异性结合激活PI3K/Akt和Ras/MAPK级联，促进上皮-间质转化（EMT）、自我更新和化疗耐药性。透明质酸在CD44蛋白N端的特化透明质酸结合结构域（HABD）与CD44结合。该结构域含有一个"连接模块"，形成专门塑造以容纳HA 6-8聚体片段的浅槽。由于HA对CD44的天然亲和力，使用透明质酸靶向CD44一直是癌症治疗中增强肿瘤药物积累的常规策略。在免疫治疗背景下，CD44介导的肿瘤细胞对HA的识别已被用于递送特定免疫细胞激动剂以帮助建立强抗肿瘤应答。
最近，Kuai及其同事报道了一种非常新颖的透明质酸交联脂质杂合纳米颗粒设计。使用携带STING（干扰素基因刺激因子）激动剂的这些杂合纳米颗粒单次剂量即可通过引发有效抗肿瘤免疫应答在C57BL/6小鼠中消除已建立的结直肠肿瘤（MC38）。虽然透明质酸确保多层脂质杂合NPs招募至肿瘤部位，但TME中释放的cGAMP激活STING途径以产生增加量的IFNβ，随后产生强抗肿瘤免疫应答。Catania等人最近的一项研究导致了使用透明质酸缀合物开发胶质母细胞瘤的局部化学免疫治疗。他们使用阿霉素（DOX）作为免疫原性细胞死亡诱导剂和CpG作为TLR-9激动剂。HA-DOX和HA-CpG的组合在原位GL261胶质母细胞瘤模型中导致一系列免疫应答。M2样小胶质细胞转化为M1型，促炎细胞因子水平升高，CD8+ T细胞应答被刺激。结果，近三分之二接受联合治疗的小鼠获得长期生存，而接受任一单药治疗的小鼠中仅有一例长期生存。在另一项针对黑色素瘤的研究中，Préat及其同事证明了递送两种不同黑色素瘤特异性抗原TRP2和Gp100的HA基纳米疫苗。在临床前环境中，它们的复合系统导致DCs增强的抗原呈递加上强CD8+ T细胞应答，导致肿瘤生长抑制和生存期延长。最近一篇综述总结了许多透明质酸导向的脂质纳米载体，与当前讨论相关的一个值得注意的例子是HABN或HA-胆红素纳米颗粒的发现。这些NPs被发现归巢至肿瘤细胞和肿瘤相关髓系细胞并递送SC144，一种STAT3途径的小分子抑制剂。这导致体内M2型TAMCs调节至较低免疫抑制表型，同时通过增强CD8+ T细胞触发免疫原性细胞死亡。更近的研究还扩展到开发靶向CD44信号途径的小分子抑制剂以引发免疫应答和CD44靶向CAR T细胞。然而，大多数靶向CD44的基于糖的免疫治疗仍围绕HA（Fig. 11）为中心。
最近，Du等人设计了一种级联纳米平台Ce6/Pt@PDA-HA（PPCH），由透明质酸（HA）、二氢卟吩e6（Ce6）、铂（Pt）纳米酶和聚多巴胺等多组分组成，以增强声动力疗法（SDT）治疗实体瘤。该研究描述了PPCH球形和稳定分散体的制备和表征，进一步确立了PPCH的CD44靶向细胞摄取和线粒体定位。体外研究显示PPCH诱导由HA介导的M2向M1表型，这种表型转变促进内源性H?O?产生，由铂纳米酶催化分解为O2，缓解肿瘤样环境中的缺氧条件。随后，借助线粒体中积累的二氢卟吩e6（Ce6）声敏剂，低强度聚焦超声（LIFU）促使产生显著量的活性氧（ROS），最终触发癌细胞杀伤。此外，PPCH被证明具有双模态成像能力，包括荧光和光声成像，用于精确肿瘤诊断。PPCH和LIFU的组合显示通过调节逆转免疫抑制和缺氧环境，在4T1荷瘤Balb/c小鼠中显著抑制肿瘤生长而无可观察毒性。
作为Table 1中强调的另一个有趣例子，Ju及其同事通过包括糖类和碳水化合物活性酶的多组分整合开发了一种三重增强免疫治疗药物（TEID）以增强抗癌活性。TEID设计为实现通过链球菌溶血素O（SLO，一种成孔毒素蛋白）的肿瘤细胞膜穿孔，以及将半乳糖（Gal）残基和神经氨酸酶（NEU）整合到肿瘤细胞膜以分别激活NK细胞和切割唾液酸以减弱免疫抑制。该研究讨论了SLO-Gal和SLO-NEU缀合物的构建并证明了其体外功能活性。进一步，透明质酸（HA），一种CD44受体靶向糖类，被用于包封SLO-Gal和SLO-NEU缀合物。体外研究揭示当TEID处理的肿瘤细胞与NK细胞孵育时的免疫介导裂解，其中SLO被验证通过穿孔肿瘤细胞增强细胞因子递送。在体内研究中，使用4T1荷瘤Balb/c小鼠，清楚显示用TEID治疗的小鼠与对照相比表现出显著肿瘤抑制，突出穿孔辅助糖重塑在癌症中的免疫治疗潜力。
**其他免疫调节多糖**
最近，源自植物和微生物的天然复杂碳水化合物在肿瘤免疫治疗领域引起关注，既作为佐剂又作为独立剂。由于其免疫调节特性加上生物相容性和低毒性，这些化合物也显示出在几种类型癌症的纳米颗粒基免疫治疗方法中使用的潜力。机制研究指出了这些多糖增强DCs成熟和功能的能力，导致改善的抗原呈递和T细胞激活。一些特定多糖还显示出固有的抗癌特性以及直接作用于淋巴细胞和中性粒细胞的能力。下面我们描述该领域的一些关键发展以及这些简单系统如何显示极其有益结果的最显著例子（Fig. 12）。
随着半乳糖凝集素抑制剂领域的进展，果胶因其生物相容性和从天然来源易于获得而在研究人员中流行。GM-CT-01（Davanat）是其中一种基于果胶的多糖，能够抑制半乳糖凝集素，也已被评估。据报道GM-CT-01在体外研究中增强T细胞的细胞毒性特性。然而，Davanat和相关果胶样品被驳斥不能有效结合经典半乳糖凝集素碳水化合物结合位点并引起抑制作用。尽管作用机制存在模糊性，观察到的有希望生理效应继续鼓励科学家研究果胶用于癌症免疫调节。另一种基于果胶的Gal-3抑制剂是富含半乳糖阿拉伯聚糖鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的多糖，称为belapectin（GR-MD-02），通过苹果果胶化学加工生产。GR-MD-02与抗OX40治疗显示协同效应以抑制肿瘤生长并增强雌性C57BL/6和Balb/c小鼠各种同基因肿瘤攻击模型中的总生存期。这种协同效应通过CD8+ T细胞依赖性机制和减少M-MDSC介导的免疫抑制介导。GR-MD-02还在各种癌症类型中与免疫检查点抑制剂如抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合评估。基于果胶的多糖中研究最多的抑制剂之一是修饰柑橘果胶或MCP，已显示通过半乳糖苷残基与半乳糖凝集素-3的抑制性结合减少肿瘤侵袭性。有趣的是，MCP治疗显示诱导肿瘤相关巨噬细胞的代谢重编程，导致肿瘤生长和转移均减少。
Guo及其同事从传统药用植物旋覆花（Inula japonica）的花中提取多糖IJP70-1，并观察到它可以通过免疫调节在斑马鱼模型中诱导抗癌活性。均一多糖IJP70-1主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖残基组成，分子量为1.019×10? Da，其中单糖单元通过特定糖苷键连接。来自斑马鱼的实验数据显示IJP70-1增强RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突状细胞上CD40、CD80、CD86和MHC-II的表达。分子机制研究得出结论，IJP70-1直接结合TLR-4和PD-1受体，分别暗示它可能通过TLR-4介导的免疫激活发挥作用，也可能作为PD-1抑制剂克服肿瘤免疫逃逸。此外，IJP70-1通过与血管内皮生长因子（VEGF）相互作用显著抑制节间血管（ISV）形成，表现出抗血管生成活性。不久之后，Dong等人报道L. deliciosus多糖（LDP）通过调节肠道菌群代谢引发免疫激活和肿瘤抑制。口服给药后，LDP显著抑制雄性Balb/c小鼠S180肿瘤（肉瘤）荷瘤模型中的实体瘤生长，高剂量（50 mg/kg和100 mg/kg）抑制率为51.61%。此外，该研究还描述LDP给药增加有益肠道菌群如乳杆菌，并诱导腺嘌呤介导的玉米素生物合成，竞争性拮抗A2A受体信号传导，随后增强某些T细胞亚群如CD4?和CD8? T细胞的激活。最后，淋巴细胞亚群分析和蛋白质组学测定证明激活的T细胞介导的肿瘤细胞免疫原性细胞死亡。
另一个有趣的例子是RRTP80–1，一种来自刺梨（Rosa roxburghii）的均一多糖。在斑马鱼异种移植模型中用RRTP80–1处理A549肿瘤导致肿瘤生长和迁移的显著抑制。此外，RRTP80–1处理上调斑马鱼模型中活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的产生，这些发现表明肿瘤抑制主要因免疫激活而发生。Liu等人报道从菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）微波提取的蛤多糖（MCP）通过其作为免疫调节剂和抗氧化剂的双重功能表现出抗肿瘤活性。分析显示蛤衍生多糖主要由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。虽然MCP处理诱导Bcl-2下调和细胞色素C和caspase-3上调，MCP还通过促进M1极化和增强巨噬细胞介导的对癌细胞的细胞毒性触发巨噬细胞激活。此外，MCP还被发现显著降低癌细胞内ROS水平并改善抗肿瘤免疫应答，而对健康巨噬细胞无明显细胞毒性。
Guo及其同事的一项研究揭示，来自药用大型真菌Fomitopsis officinalis的均一多糖FOBP90-1可以在斑马鱼模型中激活单核细胞衍生的树突状细胞和巨噬细胞。他们确认一氧化氮产生升高、吞噬活性增加以及表面成熟标志物如CD40、MHC-II、CD80和CD86的过表达。此外，FOBP90-1显示与多个关键受体包括TLR-2、TLR-4、PD-L1和VEGFR-2的相互作用，暗示其涉及免疫调节和抑制血管生成的多靶点作用机制。在后续研究中，作者还使用免疫调节多糖（PCP）、交联剂1,4-苯二硼酸BDBA和小分子化疗药物秦皮乙素制备了pH敏感性纳米颗粒以研究抗肿瘤和免疫刺激效应。用EL@PCP-BDBA NPs处理A549癌细胞后，EL@PCP-BDBA与单独秦皮乙素相比显示增强的细胞毒性。有趣的是，EL@PCP-BDBA NPs表现出模拟肿瘤微环境的pH响应释放行为。将EL@PCP-BDBA NPs给予荷瘤斑马鱼模型后，观察到NO和ROS生成增强，证明先天免疫系统的刺激以及优越的抗癌活性。该研究还显示纳米颗粒内的PCP组分促进树突状细胞成熟，如成熟标志物表达升高所确认。
在另一项研究中，Guo及其同事从食用和药用植物桔梗（Platycodon grandiflorum）中提取多糖PGP40-2B，并证明PGP40-2B通过免疫调节和抗血管生成特性具有抗癌免疫。从桔梗根分离的PGP40-2B由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，质量比为1.00:9.15:0.82:0.86:2.86。在A549肿瘤荷瘤斑马鱼模型中PGP40-2B处理显著减少肿瘤增殖和转移。PGP40-2B对血管内皮生长因子（VEGF）表现出亲和力。为评估其免疫调节能力，PGP40-2B在免疫细胞测定中测试。当暴露于DC2.4细胞和RAW264.7巨噬细胞时，观察到NO产生增加和细胞共刺激分子如CD40、CD80、CD86和MHC-II表达水平增强。此外，PGP40-2B还被发现与PD-1相互作用，暗示它也可能作为免疫检查点抑制剂以恢复T细胞协调的抗肿瘤活性。作者还从金樱子（Rosa laevigata）果实中分离和纯化了一种多糖JYP70-1并研究了其抗肿瘤活性。分析数据显示JYP70-1由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，摩尔比为4.11:3.42:1.24:1.00，在NaCl溶液中表现出紧凑卷曲结构。与先前研究一样，JYP70-1也被发现激活DC2.4树突状细胞。在斑马鱼异种移植模型中，JYP70–1显著抑制肿瘤生长和转移。
Luo等人证明来自槟榔的天然多糖导致炎症细胞因子如TNF-α和IL-6分泌增加以及NO产生增强，暗示促炎M1巨噬细胞表型。此外，作者还观察到ANP处理的巨噬细胞激活NF-κB和MAPK途径，如p65、IκBα、p38、JNK和ERK磷酸化水平增强所证明。进一步，该研究还确认ANP不结合TLR2和TLR4受体，因为ANP诱导的M1极化不受TLR2和TLR4特异性抗体影响。另一方面，内吞抑制剂通过抑制ANP内化显著减少细胞因子分泌。
最近，Li等人研究了从刺参（Stichopus japonicus）提取的多糖与抗PD1抗体组合在荷瘤小鼠模型中的免疫调节功能的潜在影响。在携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠中口服给予这些海参多糖或SCPs（有或没有抗PD1抗体）导致放大的抗肿瘤活性。通过流式细胞术和免疫组织学染色验证，显示细胞毒性CD8+ T细胞群体显著增强，同时调节性Foxp3+ CD4+ T细胞（Tregs）减少。进一步研究揭示SCPs单独增加有益肠道微生物物种并增强某些代谢物如吲哚-3-羧酸的水平，这与改善的抗癌活性相关。该研究还讨论接受SCP处理供体微生物群的小鼠显示抑制的肿瘤生长和改善的免疫谱，支持SCPs以微生物群依赖性方式发挥作用的结论。总之，天然多糖为肿瘤免疫治疗提供了独特和多方面的方法。
CD73是一种在各种肿瘤包括乳腺癌中过表达的胞外酶。它通过产生腺苷促进肿瘤微环境中的免疫抑制，腺苷抑制抗肿瘤免疫应答。最近，CD73特异性siRNA被包封在壳聚糖-乳酸纳米颗粒中以促进4T1荷瘤Balb/c小鼠模型中的靶向递送和基因沉默。使用糖靶向基因递送载体确保货物的肿瘤局部递送，从而增强免疫治疗策略的疗效。天然多糖在生物相容性和生物利用度方面提供主要优势。不同类别的衍生物在引发抗肿瘤免疫方面显示不同机制，如Fig. 12所总结。其作用机制的多样性和高度有利的安全性使其成为整合到当前癌症治疗方案中的有希望候选物。
**结论**
肿瘤细胞上改变的糖基化模式赋予其与健康细胞区分的能力。独特的糖基化特征在免疫监视期间帮助肿瘤细胞，并参与免疫逃逸和导致癌症发生、进展和转移的改变型致癌信号途径。由于低免疫原性，天然状态下的糖类如TACAs通常被认为是T细胞非依赖性抗原，只能通过B细胞激活诱导非细胞毒性IgM产生。最近的技术发展如合成糖生物学和糖工程的进步允许生产具有载体蛋白的糖缀合物。这些缀合物可以诱导向IgG的同种型转换以及T细胞参与。由于它们能够 priming 先天性和适应性免疫，唤起免疫记忆，这些糖缀合物被称为糖疫苗。最成功的糖疫苗一直是靶向糖脂来源TACAs即神经节苷脂和globosides的那些（Table 1）。糖脂和糖蛋白基抗原的差异加工可用于合理化这种优越性。首先，糖脂绕过基于MHC的呈递，而肿瘤经常下调MHC表达。糖脂由CD1d分子表达，CD1d很少被肿瘤突变或下调。其次，CD1d结合糖脂的主要靶标是iNKT细胞，其比常规CD4+和CD8+ T细胞显著更有效。尽管有这些原因，基于神经节苷脂的免疫治疗仅在被动免疫（抗GD2单克隆抗体）形式中取得成功。主动疫苗（如GM2-KLH）由于中枢耐受和神经节苷脂在正常神经组织上的高表达而持续失败。Globo-H疫苗是下一个希望之光，特别是GLORIA试验代表了患者分层和个性化治疗的现代教条。在基于糖蛋白的疫苗中，Lewis抗原仍在努力开辟作为潜在候选物的道路。然而，使用黏蛋白型O-聚糖的那些经历了成功和失败的浪潮。像Theratope（sTn-KLH）这样的制剂在体外有希望但败于临床微异质性。从裸糖转向合成糖肽（如Tn-MUC1）提供了结构刚性的非己表位，成功打破中枢耐受。
Table 1 在肿瘤免疫治疗中显示希望的糖缀合物值得注意例子的总结。
在使用糖疫苗实现有效抗癌活性后，已做出额外努力开发众多递送载体包括脂质体、纳米颗粒、纳米晶体、病毒样颗粒和3D支架以将抗肿瘤免疫接合治疗剂（如TLR/STING激动剂）递送至靶细胞。糖缀合物中多价性的使用体现了正在开发的利用免疫系统对抗癌症的创新策略，为更有效和靶向治疗提供了希望。虽然与特异性、低免疫原性和无法产生足够纯糖材料相关的挑战仍有待解决，但合成平台的快速创新加上对糖免疫学不断发展的理解正在推动该领域走向更广泛抗癌斗争中抗肿瘤免疫治疗的前沿。
**展望与作者观点**
已观察到基于糖缀合物的策略在肿瘤免疫治疗中具有重大前景。然而，为成功临床转化需要克服四个主要挑战。第一个也是最重要的是"免疫耐受"，即免疫系统对自身抗原包括某些糖类的耐受。这种耐受已被证明在体内限制基于糖的疫苗的有效性，不同于Dinutuximab（一种针对高密度GD2簇的嵌合鼠/人单克隆抗体）取得的罕见成功IgG接合。然而，强迫免疫系统打破中枢耐受以产生针对正常表达抗原的高亲和力应答可触发严重的自身免疫毒性。这在GD2靶向治疗中得到了鲜明证明，成功的抗体接合导致强烈的剂量限制性神经病理性疼痛，因为GD2也表达于周围神经纤维。耐受方面已通过使用多方面载体和佐剂如α-GalCer和两性离子多糖在一定程度上被克服。需要克服的第二个主要障碍是"糖基化异质性"和表位掩蔽。由于不同肿瘤类型之间以及单个肿瘤内糖基化模式的变异性，设计一套普遍有效的糖缀合物治疗极具挑战性。临床前模型通常利用具有均匀表达模式的细胞系模型。相反，人类肿瘤表现出广泛的患者间和肿瘤内糖多样性，包括高度可变的分支和动态截短。单糖型治疗剂的临床结果允许快速免疫逃逸，因此受到损害。多价系统已被提出作为这一挑战的解决方案，因为它们能够增强抗原密度和多样性。然而，这些合成多方面和多价系统的生物利用度和安全使用是临床适用性需要应对的下一个挑战。此外，虽然合成糖类在培养皿中完全可被抗体接近，但靶表位在3D人肿瘤内常被密集的细胞外基质网络和超唾液酸化糖萼物理隐藏或"掩蔽"。这种掩蔽使高抗体滴度完全惰性，因为抗体无法在真实患者中停靠到肿瘤细胞上。虽然传统上TACA疫苗面临的第三个关键挑战是缺乏蛋白酶体和MHC呈递加工导致无法招募T细胞应答，但使用载体蛋白似乎解决了这个问题。然而，这增加了另一个称为"载体诱导抑制"的问题，这是目前临床转化的第三个关键挑战。当小糖类与庞大蛋白质载体（如KLH）偶联时，人免疫系统将其偏好转向对外来蛋白质而不是对小糖表位的应答。研究人员正试图使用"自佐剂"疫苗设计来克服这一挑战。需要克服的第四个也是最后一个挑战是抵消免疫抑制性肿瘤微环境和可溶性抗原脱落。一方面，TAMs和MDSCs不断警惕通过使效应细胞失活来关闭ADCC。同时，晚期上皮肿瘤积极将表面糖类和黏蛋白（如MUC1或sLea）脱落到体循环中。这些自由漂浮的抗原充当"诱饵"，在体内结合和中和疫苗诱导的抗体，在它们到达物理肿瘤部位之前。研究人员认为，该领域的研究人员可以显著受益于设计复杂治疗策略的下一代技术。例如，糖蛋白质组学和质谱的进步正在改进癌症特异性糖缀合物的鉴定。向前推进，可以探索CRISPR/Cas9介导的糖工程的体内应用以操纵肿瘤糖基化以增强免疫识别。类似地，使用人工智能（AI）辅助糖生物标志物发现可以进一步加速靶标鉴定、虚拟筛选和新型基于糖的免疫疗法的鉴定，如糖修饰树突状细胞疫苗和糖靶向CAR-T细胞。因此，未来研究的重点应旨在结合这些快速发展的技术来开发个性化基于糖的疗法，以及将糖缀合物免疫治疗与其他治疗方式整合的组合策略。
